Monitoramento Funcionalidade e Morfologia da vasculatura Recrutado por fatores secretados por geradores de Células Tumorais de crescimento rápido

Summary

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Abstract

O ensaio de tampão de Matrigel subcutânea em ratinhos é um método de escolha para a avaliação in vivo dos factores de pro- e anti-angiogénicos. Neste método, os factores desejados são introduzidos em gel de ECM que imitam a frio de líquido que, após a injecção subcutânea, solidifica para formar um ambiente que imita o meio cancro. Esta matriz permite a penetração das células hospedeiras, tais como células endoteliais, e portanto, a formação de vasculatura.

Aqui propomos um novo ensaio de tampão de Matrigel modificado, que pode ser explorada para ilustrar o potencial angiogénico de um conjunto de factores segregados pelas células cancerosas, por oposição a um factor específico (por exemplo, o bFGF e VEGF) ou agente. A ficha contendo gel ECM-mímica é utilizado para introduzir o host (ou seja, mouse) com um pool de fatores secretados para a CM de células de glioblastoma geradoras de tumor de crescimento rápido. Descrevemos previamente uma extensa comparação do potencial angiogénicoU-87 MG de glioblastoma humano e o seu clone de dormente-derivada, neste sistema modelo, que mostra a angiogénese induzida em células U-87 MG parentais. O CM é preparado pela filtragem media recolhidos a partir de placas de cultura de tecido confluente de qualquer linha celular seguintes 48 horas de incubação. Assim, ele contém apenas factores segregados pelas células, sem as próprias células. Aqui descrita é a combinação de duas modalidades de imagiologia, microbolhas de imagiologia de ultra-sons com contraste e intravital endomicroscopy desfibrado-confocal, para, um em tempo real caracterização precisa da extensão, a morfologia e funcionalidade dos vasos sanguíneos recentemente formados dentro das buchas.

Introduction

O ensaio de angiogénese bujão matrigel foi descrita pela primeira vez por Kibbey et al., Em 1992, em que foi utilizado para avaliar a estimulação de angiogénese pelo SIKVAV péptido (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) ^1. Em contraste com outros ensaios in vivo da angiogénese, como o rato da angiogénese da córnea ou de bico ensaios corioalantóicas de membrana, este ensaio é relativamente fácil de realizar ^2. O gel de ECM-mímica injectada pode conter células, pró-angiogénico ou um compostos e / ou factores anti-angiogénicos. Ao avaliar a actividade de um composto anti-angiogénico, o plug normalmente contém uma mistura de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), e a substância anti-angiogénica pode ser administrada directamente na ficha ou sistemicamente ^{3, 4.}

O gel ECM-mímica é injetado por via subcutânea, onde ela se solidifica em poucos minutos. Avaliação do recrutamento dos vasos sanguíneos no tampão resultante é typically realizada por medição dos níveis de hemoglobina dentro do bujão, através da medição do sinal de fluorescência após a injecção de isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com dextrano, por imunocoloração dos cortes histológicos para marcadores específicos de endoteliais ou por células activadas por fluorescência (FACS) ^{2,5, 6.} No entanto, essa avaliação só permite a análise de ponto final e não tem informações sobre a funcionalidade e morfologia dos vasos sanguíneos. Além disso, as medições de volume de plasma, ou por níveis de hemoglobina ou utilizando dextrano-FITC como um indicador, uma vez que pode ser enganadora teor de sangue é afectada pelo tamanho dos vasos sanguíneos e a extensão de poças de sangue. Isto é especialmente importante quando a vasculatura recrutados é caracterizada pela permeabilidade aumentada e retenção (EPR) efeito ^7.

Nós aqui propor um novo, mais preciso, método de visualização dos vasos sanguíneos recrutados pela combinação de duas modalidades de imagem complementares. Higmicrobolhas h resolução com contraste ultra-som (US), combinados com intravital fibred-confocal endomicroscopy podem fornecer informações não só sobre a densidade dos vasos sanguíneos, mas também na sua morfologia e funcionalidade. Além disso, esta análise pode ser realizada em vários pontos de tempo, permitindo assim a monitorização da cinética da angiogénese. EU é uma modalidade de imagiologia largamente usada, que possui uma elevada resolução espacial para imagiologia de vasos sanguíneos, após administração intravenosa (iv) de injecção de microbolhas que permanecem exclusivamente no compartimento vascular ^8-11. As microbolhas são microbolhas cheias de gás que produzem um sinal ecogénico forte quando excitado com um impulso dos Estados Unidos e, portanto, servir como um bom agente de contraste. Imagens 3D do plugue são adquiridos usando o software sistema de imagem dos EUA após a destruição microbolhas. As imagens resultantes são compostos a partir de quadros de imagem de pré e pós-destruição das microbolhas e reflecte a diferença em intensidade da cor no vídeo. Estes overlayedas imagens são exibidas automaticamente pelo software. Por conseguinte, a percentagem de vasos funcionais dentro do bujão pode ser quantificada. Alta resolução fibered endomicroscopy confocal serve como uma modalidade de imagem complementares através de relatórios sobre a morfologia dos vasos sanguíneos. Neste método minimamente invasivo, as imagens são adquiridas após a administração iv de dextrano conjugado com FITC ^12. O polímero corantes fluorescentes na corrente sanguínea e, portanto, serve como um "agente de contraste" para os vasos sanguíneos morfologia e fluxo sanguíneo. Além disso, uma vez que o polímero é injectado a uma dimensão de 70 kDa, que pode somente cruzar vasos gotejantes como encontrado na vasculatura tumoral. Isto irá resultar em fundo elevado do dextrano marcado com FITC fora dos vasos sanguíneos. Consequentemente, endomicroscopy confocal fibered pode ser usado para visualizar características típicas do efeito EPR em tumor neovasculature- ampliados, de evacuação, os navios altamente emaranhados, com extremidades cegas.

Este modelo de sistema foi descricama na comparação do potencial angiogénico de U-87 MG de glioblastoma humano e o seu clone ¹³ dormente. Vascularização dentro dos tampões foram avaliados três semanas após a inoculação de gel de ECM-mímica. Foi mostrado que a vascularização dentro tampões contendo CM a partir de U-87 MG de crescimento rápido de células geradoras de tumores foi significativamente aumentada em termos de número, densidade e funcionalidade, quando comparada com a vascularização no interior tampões contendo CM a partir das células geradoras de tumores latentes. Assim, os autores foram capazes de concluir que CM isolado a partir de U-87 MG rápido crescimento células geradoras de tumor contém níveis mais elevados de fatores pró-angiogênicos, em comparação com o CM a partir de células geradoras tumorais inativas. Estes factores de estimular a formação de vasos sanguíneos funcionais que afectam positivamente por todos os passos da cascata angiogénica (ou seja, proliferação, brotamento, migração e finalmente, formação de estruturas tubulares de células endoteliais).

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados em conformidade com as normas de Tel Aviv University Sackler School of Medicine Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Preparação de meio condicionado Semente de 2 x 10 6 U-87 células MG em uma placa de cultura de 10 centímetros em um volume de 8 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) e solução de penicilina / estrepto…

Representative Results

Implantar plugs gel ECM-mímica com CM de rápido crescimento linha de células geradoras de tumor angiogênico U-87 MG, resulta em grande angiogênese. Este vasculatura pode ser amplamente explorado utilizando dois métodos de imagem complementares. Microbubbles imaging US contrastado revela grande recrutamento de vasos sanguíneos funcionais no plugue, ilustrando grande fluxo de sangue dentro de U-87 MG CM plugs carregados, em oposição ao fluxo de sangue indetectável dentro fichas conte…

Discussion

Combinando métodos de imagens complementares permite a obtenção de informações sobre os diferentes componentes da angiogênese 'microvasos densidade, funcionalidade e morfologia. Carregando CM em tampões de gel ECM-mímica gera um microambiente tumoral, que está separado de outras populações de células, como as células endoteliais, que são recrutados e extravasar para a ficha.

Ao realizar, em paralelo, microbolhas de imagem dos EUA com contraste e fibered imaging endomicrosco…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Rotary Vacuum Evaporator	–	–	–
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel	BD Bioscience	FAL356231	Thaw overnight, at 40C on ice
Depilatory cream	–	–	–
Vevo2100 US imaging system	VisualSonics Inc.	–	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
55 MHz 708 probe	VisualSonics Inc.	–	–
Vevo2100 imaging software	VisualSonics Inc.	–	–
VialMix	DEFINITY Imaging	VMIX	–
DEFINITY microbubbles	DEFINITY Imaging	DE4	Activate for 45 seconds using Vialmix before use
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)	Mauna Kea Technologies	–	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
ProFlex MiniO/30 probe	Mauna Kea Technologies	–	–
70 kD FITC-labeled Dextran	Sigma-Aldrich	46945	–
ImageCell software	Mauna Kea Technologies	–	–
Calibration Kit	Mauna Kea Technologies	–	–
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco Life Tecchnologies	41965-039
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution	Biological Industries	03-032-1B