监控功能和血管形态由快速增长的肿瘤产生细胞分泌的因素招募
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
在小鼠中的皮下基质胶栓测定是用于亲和抗血管生成因子在体内的评价所选择的方法。在该方法中，期望的因素被引入到冷液体的ECM-模拟凝胶其中，皮下注射后，固化形成模仿癌环境的环境。这个矩阵允许的宿主细胞，如内皮细胞，和血管因此，形成的渗透。
这里我们提出了一种新的改性的基质胶塞测定法，其可被利用来说明由癌细胞分泌的因子池的血管生成潜力，而不是一个特定的因子（ 例如，bFGF及VEGF）或代理。含ECM-模拟凝胶插头用来引进主机（ 即鼠标）与分泌，以快速增长的肿瘤生成胶质母细胞瘤细 胞的CM因素池。我们前面所述的血管生成潜在的广泛的比较的U-87 MG人类成胶质细胞瘤及其蛰伏衍生克隆，在该系统模型，示出在U-87 MG亲代细胞诱导的血管生成。所述CM通过过滤从任一细胞系的汇合组织培养板下面48小时培养收集介质制备。因此，它仅包含由细胞分泌的因素，而不细胞本身。这里描述的是两个成像模态的组合，微泡超声造影成像和活体纤维质共焦显微内镜，为准确，实时的程度，形态表征插头内新形成的血管和功能。
Introduction
基质胶塞血管生成测定首先由Kibbey 等人于1992年，在那里它被用来由肽SIKVAV（丝氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸）1来评估血管生成的刺激说明。相对于其他的体内血管发生测定法，像鼠标角膜血管发生或鸡胚尿囊膜测定法，该测定法是比较容易进行2。注入的ECM-模拟凝胶可包含细胞，促血管生成或抗血管生成的化合物和/或因素。当评估抗血管生成化合物的活性，所述插头通常包含的血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）的混合物中，并且所述抗血管生成物质可直接施用到插头或全身三4。
对ECM-模拟凝胶皮下注射那里分钟内固化。血管招聘中产生的插头评估。典型ý通过以下注射荧光素异硫氰酸（FITC）测定血红蛋白水平内塞，通过荧光信号的测量进行标记的葡聚糖，通过组织学切片内皮特异性标记物的免疫染色或通过荧光激活细胞分选（FACS）2,5， 6。但是，此评价只允许终点分析，缺乏有关的血管的功能和形态信息。此外，血浆量的测量结果，无论是由血红蛋白水平或通过使用葡聚糖-FITC是一个指标，可能会产生误导，因为血液含量是受血管的大小和血停滞池的程度。这是特别重要的，当招募血管的特征在于增强的渗透性和保留（EPR）效果7。
我们在此通过结合两个互补成像方式提出了一种新的，更精确的，方法的招募血管可视化。 HIGH-分辨率微泡超声造影（美国）联合活fibred共焦显微内镜不仅能够提供有关血管密度，同时也对自己的形态和功能的信息。此外，这种分析可以在几个时间点，从而使监控血管发生动力学来执行。美国是一种广泛使用的成像模态而具有以下静脉内（IV）注射仍然存在只在血管隔室8-11微泡的高空间分辨率的血管成像。微泡是产生一个强回声信号时与美国脉冲激发，因此可作为一个良好的造影剂气体填充的微泡。使用下列微泡破坏美国成像系统软件中获取的插头的3D图像。所产生的图像是由前，后破坏微泡的图像帧组成的，并反映在彩色视频强度差。这些叠加图像由软件自动显示。因此，插头内的功能血管的百分比可以量化。纤维状共聚焦显微内镜高分辨率作为通过血管形态报告的补充成像方式。在这种微创方法，图像采集的FITC标记的右旋糖酐12静脉给药后。荧光聚合物染料的血液，从而作为“造影剂”的血管形态和血流。此外，由于所注入的聚合物是在70 kDa的大小，它只能交叉渗漏血管如肿瘤血管中找到。这将导致从血管外的FITC-标记的葡聚糖的高背景。因此，纤维状的共聚焦显微内镜可用于可视化的EPR效应典型特征在肿瘤neovasculature-放大，泄漏的，高度缠结的船只，具有平端。
该系统模型descri床的U-87 MG人脑胶质瘤和休眠克隆13的血管生成潜力的比较。插头内血管进行评价后三周的ECM-模拟凝胶接种。结果表明，含有的CM从插头内的血管的U-87 MG快速增长的数量，密度和功能性，方面当与含有的CM从休眠肿瘤产生的细胞内塞血管相比肿瘤产生细胞显著增加。因此，研究者们能够得出这样的结论CM从隔离U-87 MG快速增长的肿瘤细胞产生含有较高水平的促血管生成因子，从休眠的肿瘤细胞产生的CM相比。这些因素刺激功能血管的形成通过积极地影响所有步骤的血管发生级联（ 即 ，增殖，出芽，迁移，最后，形成内皮细胞的管状结构）。
Protocol
Representative Results
Discussion
结合互补的成像方法允许在不同的血管生成组件的微血管密度，功能和形态的信息的获取。在ECM-模拟凝胶塞装载的CM产生一个肿瘤微环境，这是从其他细胞群中分离，如内皮细胞，该被招募并渗出到插头。
通过执行，并行地，微泡造影美国成像和纤维状共聚焦显微内镜成像，我们可以得出结论，一池由快速生长的血管生成的肿瘤产生的细胞分泌的因素，而不癌细胞本身，不?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
Referências
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