We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
マウスの皮下マトリゲルプラグアッセイは、プロ及び抗血管新生因子のインビボ評価のために選択される方法である。この方法では、所望の因子を皮下注射した後、癌の環境を模倣する環境を形成するために固化し、冷液体ECM模倣ゲルに導入される。このマトリックスは、内皮細胞、および血管系の、したがって、形成などの宿主細胞の浸透を可能にする。
本明細書において、我々は、特定の因子( 例えば、bFGFおよびVEGF)または薬剤とは対照的に、癌細胞によって分泌される因子のプールの血管新生可能性を例示するために利用することができる新たな変更されたマトリゲルプラグアッセイを、提案する。 ECM-模倣ゲルを含むプラグは急速に成長する腫瘍を発生する神経膠芽腫細胞のCMに分泌因子のプールでホスト( すなわち、マウス)を導入するために利用されている。我々は以前の血管新生能の大規模な比較を記載しているU-87 MG親細胞で誘導される血管新生を示すこのシステムモデルでU-87 MGヒト神経膠芽とその休眠由来のクローン、、。 CMは、48時間のインキュベーション後の細胞株のいずれかのコンフルエントな組織培養プレートから収集媒体を濾過することによって調製される。それゆえ、細胞自体ない細胞によって分泌因子のみを含有する。ここで説明する二つのイメージングモダリティの組み合わせである、プラグ内の新たに形成された血管の大きさ、形態及び機能の正確なリアルタイムの特性解析のために、造影超音波イメージングと生体繊維質共焦点内視をマイクロバブル。
マトリゲルプラグ血管形成アッセイは、最初Kibbey らにより記載された。それは、ペプチドSIKVAV(のSer-イルリジンヴァルのAla-ヴァル、1)血管新生刺激を評価するために使用された1992年。他のin vivo血管新生アッセイとは対照的に、マウス角膜血管新生またはニワトリ絨毛尿膜アッセイのように、このアッセイは、2を実行することは比較的容易である。注入されたECM模倣ゲルは細胞が、血管新生促進または抗血管新生化合物および/または因子を含んでいてもよい。抗血管新生化合物の活性を評価する場合、プラグは、通常、血管内皮増殖因子(VEGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)の混合物を含み、抗血管新生物質が、プラグに直接投与または全身3ことができる4。
それは数分以内に固化する場合ECM模倣ゲルを皮下注射する。その結果、プラグの血管のリクルートの評価はtypicallですyは、フルオレセインイソチオシアネートの注射(FITC)以下蛍光シグナル測定により、プラグ内のヘモグロビンレベルを測定することによって行わは、内皮特異的マーカーの組織学的切片の免疫染色により、または蛍光活性化細胞選別(FACS)2,5により、デキストランを標識6。しかし、この評価は、エンドポイント分析を可能にし、血管の機能および形態学に関する情報を欠いている。血液量は、血管の大きさ、血液の停滞プールの程度によって影響されるので、また、血漿量の測定は、ヘモグロビンレベル、または指標としてデキストランFITCのいずれかを使用して、誤解を招くかもしれない。動員、血管系の透過性が向上し、保持(EPR)効果7によって特徴付けられる場合に特に重要である。
我々は、ここで二つの相補的なイメージングモダリティを組み合わせることによって動員、血管の可視化のための新たな、より正確な、方法を提案する。 HIG血管密度は約だけでなく、その形態および機能だけでなく情報を提供することができる生体fibred共焦点内視と組み合わさ時間分解能のマイクロバブルコントラスト増強超音波(US)。さらに、この分析は、それによって血管新生動態のモニタリングを可能にするいくつかの時点で行うことができる。米国は、血管区画8-11に独占的に残っているマイクロバブルの静脈内(IV)注射後の血管の画像化のための高空間分解能を持って広く利用されている画像診断法である。マイクロバブルは、米国のパルスで励起し、良好な造影剤として作用するとき、強いエコー源信号を生成するガス充填マイクロバブルである。プラグの3D画像は、マイクロバブルの破壊以下の米国イメージングシステムソフトウェアを使用して取得される。得られた画像は、マイクロバブルの前後の破壊の画像フレームから構成され、色の映像強度の差を反映している。これらのオーバーレイ画像は自動的にソフトウェアによって表示されます。したがって、プラグ内の機能血管の割合を定量することができる。共焦点内視繊維質の高解像度は、血管の形態の報告による補完的なイメージングモダリティとして機能します。この低侵襲性の方法では、画像は、FITC結合デキストラン12の静脈内投与後に取得される。蛍光ポリマーは、血流を染色し、従って、血管の形態及び血流のための「造影剤」として機能する。注入されたポリマーは、70キロダルトンの大きさであるので、腫瘍脈管構造に見られるようにまた、それだけで漏れやすい血管を通過することができる。これは、血管外のFITC標識デキストランの高いバックグラウンドをもたらす。その結果、繊維質の共焦点内視はneovasculature-腫瘍に平滑末端を有する拡大された、漏出、高もつれ血管を、EPR効果の典型的な特徴を視覚化するために使用することができる。
このシステムモデルはdescriたU-87 MGヒト神経膠芽とその休眠クローン13の血管新生能の比較でベッド。プラグ内の血管新生は、3週間ECM-模倣ゲル接種後に評価した。これは、休止中の腫瘍生成細胞からのCMを含むプラグ内の血管新生と比較した場合、U-87 MG急成長している腫瘍生成細胞からのCMを含むプラグ内の血管新生が著しく、数、密度および機能性の面で増加したことが示された。したがって、著者らは、CMがU-87 MG急成長している腫瘍を発生する細胞から単離されたが、休眠腫瘍生成細胞からのCMと比較して、血管新生促進因子のより高いレベルが含まれていると結論することができました。これらの要因は、積極的に、血管新生カスケード( すなわち 、増殖、発芽、遊走および内皮細胞の管状構造の最後に、形成)のすべてのステップに影響を与えることによって、機能的な血管の形成を刺激する。
補完的なイメージング法を組み合わせることにより、異なる血管新生コンポーネントの微小血管密度、機能性と形態学上の情報の取得を可能にする。 ECM-模倣ゲルプラグ上のローディングCMは、プラグに募集し、浸出された内皮細胞のように、他の細胞集団から分離され、腫瘍の微小環境を生成します。
行うことにより、並行して、造影USイメージングをマイクロバブル?…
The authors have nothing to disclose.
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
Depilatory cream | – | – | – |
Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |