Функция контроля и морфология сосудистой Завербован факторов, секретируемых быстрорастущих опухолевых генерирующих клеток
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
Подкожной матригель плагин анализ у мышей методом выбора для оценки в естественных условиях про- и анти-ангиогенных факторов. В этом способе желаемые факторы вводятся в холодной жидкости ECM-имитируют гель, который, после подкожной инъекции, затвердевает с образованием среды, имитирующего среду рака. Эта матрица позволяет проникновение клеток-хозяев, таких как эндотелиальные клетки, а следовательно, к образованию сосудистой.
В этом мы предлагаем новую модифицированную Матригель штекер анализа, которые могут быть использованы, чтобы проиллюстрировать ангиогенный потенциал пула факторов, секретируемых раковых клеток, в отличие от конкретного фактора (например, bFGF и VEGF) или агента. Вилка, содержащий ECM-мимические гель используется, чтобы ввести множество (т.е., мыши) с бассейном факторов, выделяемых на КМ быстрорастущих опухолей, генерирующих клеток глиобластомы. Ранее мы описали обширную сравнение ангиогенного потенциалаU-87 мг глиобластомы человека и его бездействующим, полученных клона, в этой системе модели, показывающий индуцированный ангиогенез в U-87 мг родительских клеток. CM готовится путем фильтрации, собранные СМИ из сливной культуры ткани пластин любой клеточной линии следующие 48 ч инкубации. Таким образом, он содержит только факторы, секретируемые клетками без самих клеток. Описанный здесь сочетание двух методов визуализации, микропузырьки контрастным усилением ультразвуковой визуализации и прижизненный расслаивается-конфокальной эндомикроскопии, для точного, в режиме реального времени характеристике степени, морфологии и функциональности новообразованных сосудов в пределах зажигания.
Introduction
Матригель плагин ангиогенез анализ был впервые описан Kibbey и др. В 1992, где он был использован для оценки ангиогенеза стимуляцию пептидной SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. В отличие от других в естественных условиях ангиогенеза анализов, как мыши роговицы ангиогенеза или хорионалантоисной мембраны анализов, этот анализ относительно легко выполнить два. Вводят ECM-мимические Гель может содержать клетки, проангиогенных или антиангиогенные соединения и / или факторов. При оценке активности анти-ангиогенного соединения, вилка обычно содержит смесь фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста фибробластов (FGF), а анти-ангиогенный вещество может быть введено непосредственно в вилке или системно 3, 4.
ЕСМ-имитируют гель инъецируют подкожно, где он затвердевает в течение нескольких минут. Оценка набора кровеносных сосудов в результате вилки typicallу выполняется путем измерения уровней гемоглобина в вилке, путем измерения сигнала флуоресценции после инъекции флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) меченных декстран, иммунным окрашиванием гистологических срезов для эндотелиальных-специфических маркеров или сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) 2,5, 6. Тем не менее, эта оценка позволяет только анализ конечной точки и не содержит информации о функциональности и морфологии кровеносных сосудов. Кроме того, измерения объема плазмы, либо уровня гемоглобина или с помощью декстран-FITC в качестве индикатора, может ввести в заблуждение, так как содержание в крови зависит от размера кровеносных сосудов и степени застойных лужах крови. Это особенно важно, когда на работу сосудистой характеризуется повышенной проницаемости и удерживания (EPR) эффекта 7.
Здесь мы предлагаем новый, более точный, метод визуализации, набранных кровеносных сосудов путем объединения двух взаимодополняющих методов визуализации. Higч разрешения микропузырьки с контрастным усилением ультразвуковое исследование (США) в сочетании с прижизненной расслоенной-конфокальной эндомикроскопии может предоставить информацию не только о плотности кровеносных сосудов, но и на их морфологии и функциональности. Кроме того, этот анализ может быть выполнен в нескольких временных точках, таким образом, позволяя мониторинг кинетики ангиогенеза. США является широко используемым изображений модальности, который обладает высоким пространственным разрешением для визуализации кровеносных сосудов после внутривенного (IV) введения микропузырьков, которые остаются исключительно в сосудистой отсеке 8-11. Микропузырьки газонаполненные микропузырьки, которые производят сильное эхогенный сигнал при возбуждении импульсом США и, таким образом, служат хорошим контрастным веществом. 3D-изображения штекера приобретаются с помощью системы визуализации США ПО следующую уничтожения микропузырьков. Полученные изображения состоят из кадров изображения пред- и пост-разрушения микропузырьков и отражают разницу в интенсивности видео в цвете. Они перекрытыизображения автоматически отображаются с помощью программного обеспечения. Следовательно, процентов функциональных судов, находящихся в вилки может быть количественно. Высокое разрешение расслаивается конфокальной эндомикроскопии служит в качестве дополнения метода визуализации, сообщая о кровеносные сосуды морфологии. В этом минимально инвазивных методов, изображения получены следующие внутривенного введения FITC-конъюгированного декстрана 12. Флуоресцентный полимер окрашивает кровь и, таким образом, выступает в качестве "контрастного вещества» для кровеносных сосудов морфологии и кровотока. Кроме того, поскольку полимер является вводили в размере 70 кДа, он может только пересекают незакрытой таре, которые содержатся в сосудистой сети опухоли. Это приведет к высокой фоне с FITC-меченого декстрана вне сосудов. Следовательно, расслаивается конфокальной эндомикроскопии может быть использован для визуализации типичные характеристики эффекта ЭПР в опухоли neovasculature- увеличена, протекающие, очень запутанную сосуды, с тупыми концами.
Эта модель система descriкровать в сравнении ангиогенеза потенциала U-87 MG глиобластомы человека и его покоя клона 13. Васкуляризация в пробках оценивали три недели после ECM-мимические гель прививки. Было показано, что васкуляризация в заглушками, содержащих см от U-87 MG быстро растущая опухоль, генерирующих клетки была значительно увеличена с точки зрения количества, плотности и функциональности, по сравнению с васкуляризации в заглушками, содержащих см от спящих опухолевых генерирующих клеток. Таким образом, авторы смогли сделать вывод, что СМ, выделенный из U-87 мг быстрорастущих опухолевых клеток, генерирующих содержит более высокие уровни про-ангиогенных факторов, по сравнению с КМ от неактивных опухолевых клеток, генерирующих. Эти факторы стимулируют формирование функциональных кровеносных сосудов положительно влияет на все этапы ангиогенеза каскада (т.е., пролиферации, прорастания, миграции и наконец, формирование трубчатых структур эндотелиальных клеток).
Protocol
Representative Results
Discussion
Сочетание взаимодополняющих методов визуализации позволяет приобретение информации о различных компонентах ангиогенеза »микрососудов плотности, функциональности и морфологии. Загрузка CM на ECM-мимические зажигания гель создает микросреду опухоли, которая отделена от других клеточ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
Referências
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
- Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
- Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395 (2012).
