Hızlı büyüyen Tümör üreten hücreleri tarafından salgılanan faktörler tarafından işe alınmış İzleme İşlevsellik ve vaskülatürüne morfolojisi
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
farelere subkutan olarak Matrigel fiş deney pro- ve anti-anjiyojenik faktörlerin in vivo değerlendirilmesi için tercih edilen bir yöntemdir. Bu yöntemde, arzu edilen faktörler, deri altına enjeksiyon sonrası, kanser ortamını taklit eden bir ortam oluşturmak üzere katılaşmaktadır soğuk sıvı ECM mimik jel içine yerleştirilir. Bu matris, endotel hücreleri ve damar nedenle oluşumu gibi konakçı hücreler, bir şekilde nüfuz etmesini sağlamaktadır.
Bu yazıda, belirli bir etken (örneğin, bFGF ve VEGF) veya ajana karşı, kanser hücreleri tarafindan salgılanan faktörlerle havuzunun anjiyojenik potansiyelini göstermektedir için kullanılabilir yeni bir modifiye edilmiş Matrigel fiş deneyi önermektir. ECM-mimik jel içeren fiş-hızlı büyüyen tümör üreten glioblastoma hücrelerinin CM salgılanan faktörlerin bir havuzlu ev sahibi (yani, fare) tanıtmak için kullanılır. Biz daha önce anjiyojenik potansiyeli geniş bir karşılaştırma tarif varU 87 mg ana hücrelerde neden olduğu anjiyojenez gösteren U 87 mg insan glioblastoma ve bu sistem modeli olan atıl türetilmiş klon. CM 48 saat kuluçkadan sonra hücre hattı ya da bir birleşik doku kültürü plakalarından toplanan ortamı filtre edilerek hazırlanır. Dolayısıyla, bu hücrelerin kendileri olmadan hücreler tarafından salgılanan tek faktörler içerir. İki görüntüleme yöntemlerinin kombinasyonu burada açıklandığı fişleri içinde yeni oluşan kan damarlarının doğru, gerçek zamanlı ölçüde, morfoloji karakterizasyonu ve işlevsellik için, kontrastlı ultrason görüntüleme ve Intravital fibered-konfokal endomikroskopi mikrokabarcıkları.
Introduction
Matrigel fiş anjiyojenez tahlil, ilk önce Kibbey ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir. Bu peptid SIKVAV (Ser-lle-Lys-Val-Ala-Val) 1 ile anjiyojenez uyarılmasını elde etmek için kullanılmıştır 1992 yılında. Başka in vivo anjiyojenez deneylerinin aksine, fare korneal anjiyojenez veya tavuk koriallantoik zar deneylerinde olduğu gibi, bu deney 2 gerçekleştirmek için nispeten kolaydır. enjekte ECM mimik jel hücreleri, pro-anjiyojenik veya bir anti-anjiyojenik bileşikler ve / veya faktörler içerebilir. Bir anti-anjiyojenik bileşiğinin etkinliğini değerlendirerek, fiş normal vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) 'in bir karışımını ihtiva eder ve anti-anjiyojenik bir madde, doğrudan fiş ya da sistemik olarak 3 içine tatbik edilebilir, 4.
Birkaç dakika içinde katılaşır nerede ECM-mimik jel deri altına enjekte edilir. Ortaya çıkan fiş kan damarı işe değerlendirilmesi typicall olduğunuY flöresin izotiyosiyanat enjeksiyonu (FITC), aşağıdaki flüoresan sinyal ölçümü ile, tıkacın içinde hemoglobin düzeyi ölçülerek yapılan endotel özel markörler için histoloji kısımlarının immün ya da sıralama floresan-aktive edilmiş hücre (FACS) 2,5 ile, dekstran -etiketli 6. Ancak, bu değerlendirme sadece uç nokta analizi sağlar ve kan damarlarının işlevleri ve morfolojisi hakkında bilgi yoksun. Kan içeriği damar büyüklüğü ve kan durgun su ölçüde etkilenir Ek olarak, plazma hacmi ölçümleri ya da hemoglobin düzeyleri ile ya da bir gösterge olarak dekstran-FITC ile, yanıltıcı olabilir. Işe damar gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisi 7 ile karakterizedir Bu özellikle önemlidir.
Biz burada iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemleri birleştirerek işe kan damarlarının görüntülenmesi için yeni, daha hassas, yöntem öneriyoruz. Higkan damarı yoğunluğu hakkında değil, aynı zamanda kendi morfolojisi ve işlevselliği değil sadece bilgi verebilir Intravital lifli-konfokal endomikroskopi ile birlikte h-çözünürlüklü mikrokabarcıklar kontrast geliştirilmiş ultrason (US). Ayrıca, bu analiz, böylece anjiyojenez kinetik izlenmesine olanak veren çeşitli zaman noktalarında gerçekleştirilebilir. ABD vasküler bölmeye 8-11 münhasıran kalır mikrokabarcıkların intravenöz (iv) enjeksiyonu takiben kan damarları görüntüleme için yüksek uzaysal çözünürlüğü sahip bir yaygın kullanılan görüntüleme yöntemidir. Mikrokabarcıklar bir ABD darbesi ile heyecanlı ve böylece iyi bir kontrast madde olarak hizmet zaman güçlü bir ekojenik sinyal üretmek gaz dolu mikrokabarcıklar vardır. Fiş 3D görüntüler mikro kabarcıklar imha aşağıdaki ABD görüntüleme sistemi yazılımı kullanılarak elde edilir. Ortaya çıkan görüntüler mikro-kabarcıkların öncesi ve sonrası imha görüntü karelerinden oluşan ve renk video yoğunluğundaki farkı yansıtır. Bu yerleştirilmiştirGörüntüler otomatik olarak yazılım tarafından görüntülenir. Sonuç olarak, fiş içinde fonksiyonel damarların yüzde belirlenebilir. Konfokal endomikroskopi lifli Yüksek çözünürlüklü kan damarları morfoloji raporlanması ile tamamlayıcı görüntüleme yöntemi olarak hizmet vermektedir. Bu minimal invaziv yöntemde, görüntüler FITC konjuge dekstran 12 iv uygulamasını takiben elde edilir. floresan polimer kana boyayan ve böylece kan damarları morfoloji ve kan akışı için bir 'kontrast madde' olarak hizmet vermektedir. Enjekte polimer 70 KDa bir boyutta olduğu tümör damar sistemi içinde bulunan Dahası, sadece sızan damarları geçebilir. Bu, kan damarlarının dışında FITC etiketli dekstran yüksek bir arka plan ile sonuçlanacaktır. Sonuç olarak, lifli konfokal endomikroskopi kör uçlar ile, tümör neovasculature- büyütülmüş, sızan, son derece karışık damarları EPR etkisi tipik özelliklerini görselleştirmek için kullanılabilmektedir.
Bu sistem modeli descri edildiU-87 MG insan glioblastoma ve uykuda klon 13 anjiyojenik potansiyeli karşılaştırıldığında yatak. Fişler içinde damarlanması üç hafta ECM-mimik jel aşılama sonrası değerlendirildi. Bu gösterildi bundan CM içeren fişler içinde vaskülarizasyon U-87 MG uyuyan tümör üreten hücrelerden CM içeren fişler içinde damarlanma ile karşılaştırıldığında tümör üreten hücreler önemli ölçüde sayı, yoğunluk ve işlevsellik bakımından artmıştır hızlı büyüyen. Bu nedenle, yazarlar CM izole sonucuna mümkün U 87 mg hızlı büyüyen tümör hücreleri üreten atıl tümör üreten hücrelerden CM kıyasla pro-anjiyojenik faktörler arasında yüksek düzeyde ihtiva etmektedir. Bu faktörler, (son olarak endotelyal hücrelerin tüp şekilli yapıların oluşumunu, yani, proliferasyon, çimlenme, göç ve) pozitif anjiyojenik kaskadın tüm adımları etkileyerek fonksiyonel kan damarlarının oluşumunu teşvik eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tamamlayıcı görüntüleme yöntemleri birleştiren farklı anjiyogenez bileşenlerinin damar yoğunluk, fonksiyonellik ve morfolojisi hakkında bilgi iktisap izin verir. ECM-mimik jel fişler üzerinde yükleme CM fişi içine işe ve damar dışına olan endotel hücreleri gibi, diğer hücre popülasyonlarının ayrılan bir tümör mikro, üretir.
Paralel, performans olarak, kontrastlı ABD görüntüleme ve lifli konfokal endomikroskopi görüntüleme mikrokabarcıkları, biz kanser h…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
Referências
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
- Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
- Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395 (2012).
