Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridação em<em&gt; Xenopus</em

Steven J. Deimling; Rami R. Halabi; Stephanie A. Grover; Jean H. Wang; Thomas A. Drysdale

doi:10.3791/51526

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Artigo de método

Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado

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DOI:

10.3791/51526

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12 de janeiro de 2015

Steven J. Deimling¹ , Rami R. Halabi²^,³ , Stephanie A. Grover⁴ , Jean H. Wang²^,⁵ , Thomas A. Drysdale²^,⁴^,⁵

¹Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, ²Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, ³Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, ⁴Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, ⁵Department of Paediatrics, University of Western Ontario

Neste artigo

Resumo

O embrião de Xenopus laevis continua a ser excepcionalmente útil no estudo do desenvolvimento inicial devido ao seu grande tamanho e facilidade de manipulação. É fornecido um protocolo simplificado para o protocolo de hibridização in situ de montagem inteira que pode ser usado na identificação de órgãos específicos neste sistema modelo.

Resumo

Organogênese é o estudo de como os órgãos são especificados e, em seguida, adquirem sua forma e funções específicas durante o desenvolvimento. O embrião de Xenopuslaevis é muito útil para estudar a organogênese porque seu grande tamanho os torna muito adequados para identificar órgãos nas primeiras etapas da organogênese. Neste momento, o principal método usado para identificar um órgão ou primórdio específico é a hibridização in situ de montagem inteira com sondas de RNA antisense marcadas específicas para um gene que é expresso no órgão de interesse. Além disso, é relativamente fácil manipular genes ou vias de sinalização em Xenopus e a hibridização in situ permite testar mudanças na presença ou morfologia de um órgão-alvo. A hibridização in situ de montagem inteira é um protocolo de vários dias com muitas etapas envolvidas. Aqui, fornecemos um protocolo simplificado com número reduzido de etapas e reagentes usados que funciona bem para ensaios de rotina. Os robôs de hibridização in situ facilitaram muito o processo e detalhamos como e quando utilizamos essa tecnologia no processo. Uma vez concluída uma hibridização in situ, capturar a melhor imagem do resultado pode ser frustrante. Fornecemos conselhos sobre como otimizar a imagem dos resultados da hibridização in situ. Embora o protocolo descreva a avaliação da organogênese em Xenopus laevis, o mesmo protocolo básico pode quase certamente ser adaptado para Xenopus tropicalis e outros sistemas modelo.

Introdução

O padrão de expressão de um gene específico é uma informação importante para determinar o papel potencial desse gene no desenvolvimento de um órgão ou tipo de célula específico. Simplificando, se não for expresso na hora e no lugar certos, é improvável que desempenhe um papel fundamental. Em Xenopus, como na maioria dos embriões iniciais, o ensaio mais comumente usado para detectar a expressão de um gene é a hibridização in situ de montagem inteira usando sondas de RNA antisense marcadas. O uso de coloração de anticorpos para avaliar a expressão de um gene em Xenopus está se tornando mais comum à medida que os pesquisadores descobrem ant....