A Mouse Modell for Patogen Utløst kronisk betennelse på lokale og systemiske nettsteder

Summary

Dyremodeller har vist seg å være uvurderlig verktøy i å definere vert og patogen spesifikke mekanismer som bidrar til utvikling av kronisk betennelse. Her beskriver vi en musemodell for oral infeksjon med humant patogen Porphyromonas gingivalis og detalj metoder for å vurdere utviklingen av betennelse på lokale og systemiske nettsteder.

Abstract

Kronisk betennelse er en viktig driver for patologisk vevsskade og en samlende karakteristikk av mange kroniske sykdommer hos mennesker, inkludert neoplastisk, autoimmune og kroniske inflammatoriske sykdommer. Vekst bevis impliserer patogen-indusert kronisk betennelse i utvikling og progresjon av kroniske sykdommer med en lang rekke kliniske manifestasjoner. På grunn av den komplekse og multifaktorielle etiologi av kronisk sykdom, designe eksperimenter for bevis på kausalitet og etablering av mekanistiske koblinger er nesten umulig i mennesker. En fordel med å bruke dyremodeller er at både genetiske og miljømessige faktorer som kan påvirke løpet av en bestemt sykdom kan kontrolleres. Dermed utforme relevante dyremodeller av infeksjon representerer et viktig steg i å identifisere vert og patogen spesifikke mekanismer som bidrar til kronisk betennelse.

Her beskriver vi en musemodell av patogen-indusert kronisk oppblåstmmation på lokale og systemiske nettsteder etter infeksjon med oral patogen Porphyromonas gingivalis, en bakterie nært forbundet med menneskelig periodontal sykdom. Oral infeksjon i spesifikt patogen fri mus induserer en lokal betennelsesreaksjon som fører til ødeleggelse av tann støtte alveolar bein, et kjennetegn på periodontal sykdom. I en etablert musemodell for aterosklerose, infeksjon med P. gingivalis akselererer inflammatorisk plaque-avleiring i aorta sinus og innominate arterie, fulgt av aktivering av det vaskulære endotelium, en økt immuncelle infiltrat og forhøyet ekspresjon av inflammatoriske mediatorer innen lesjoner. Vi detalj metoder for vurdering av betennelse på lokale og systemiske nettsteder. Bruken av transgene mus og definert bakterie mutanter gjør denne modellen spesielt egnet til å identifisere både vert og mikrobielle faktorer involvert i initiering, progresjon, og resultatet av sykdommen. Additionally, kan modellen brukes til å screene for nye terapeutiske strategier, inkludert vaksinering og farmakologisk intervensjon.

Introduction

Kronisk betennelse er en viktig driver for patologisk vevsskade og en samlende karakteristikk av mange kroniske sykdommer hos mennesker. Disse sykdommene inkluderer neoplastiske, autoimmune og kronisk inflammatoriske sykdommer ^1. Årsakene til mange kroniske sykdommer er fortsatt uklart, men er forstått å være kompleks og multifaktoriell, som involverer både genetisk disposisjon og innføring av miljøfaktorer. Mens perpetuators på betennelse forblir unnvikende, de cellulære og molekylære profiler av immunaktivering lapper betydelig med disse mønstrene observert i verts svar på patogener ^to.

Montering bevis impliserer infeksjon med mikrobielle patogener i utvikling og progresjon av kronisk betennelse og dens mangfoldige kliniske manifestasjoner ^2,3. Patogener kan indusere og opprettholde kronisk betennelse direkte undergraving vertens immunsystemet og etablere vedvarende infeksjoner 3. Dermed vil en detaljert forståelse av mekanismene hvorved spesifikke patogener indusere kronisk betennelse kan ha vesentlig betydning for folkehelsen, så vel som behandling og forhindring av mange kroniske sykdommer.

Selv om vert og patogen spesifikke mekanismer som bidrar til induksjon og vedlikehold av kronisk inflammasjon erdårlig forstått, fremskritt innen modellering av patogen-indusert kronisk betennelse har begynt å videreutvikle vår forståelse av disse prosessene. The P. gingivalis oral smitte modellen er et unikt, godt karakterisert musemodell av patogen-indusert kronisk betennelse som tillater analyse av vert og patogen spesifikke mekanismer som bidrar til kronisk betennelse på lokale (oral bentap) og systemiske nettsteder (aterosklerose) ^5,6.

P. gingivalis er en gram-negativ, anaerob patogen oral implisert i human periodontal sykdom, en infeksjon drevet kronisk inflammatorisk sykdom karakterisert ved ødeleggelse av tannstøttevevet ^7.. I tillegg til patologi i den innledende infeksjonsstedet, oppsamling av bevis impliserer P. gingivalis indusert kronisk betennelse i utvikling og progresjon av systemiske sykdommer, inkludert aterosklerose ^5, en sykdom karakterisert ved kronisk inflammation av den arterielle karvegg. Oral infeksjon i spesifikt patogen fri mus med P. gingivalis induserer en lokal betennelsesreaksjon som fører til ødeleggelse av tann støtte alveolar bein ^åtte. P. gingivalis kan utvinnes fra munn av infiserte mus opp til 42 dager etter infeksjon ⁸ og muse utvikle høye nivåer av patogen-spesifikk serum antistofftiter ^ni. I et etablert musemodell av aterosklerose ved hjelp Apolipoprotein-E ^{- / -} mus (ApoE ^{- / -),} oral infeksjon med P. gingivalis induserer kronisk betennelse som driver inflammatorisk avleiring i aorta sinus ¹⁰ og innominate arterie ^11. Progressive betennelse i innominate lunge P. gingivalis -infected mus kan overvåkes i levende dyr ved hjelp av in vivo MR. Histologisk arterielle lesjoner fra P. gingivalis -infected mus utviser økt opphopning av lipider accompalegges ved aktivering av det vaskulære endotelium, en økt immuncelle infiltrat og forhøyet ekspresjon av inflammatoriske mediatorer ^12. Ved å bruke denne modellen i knockout mus har belyst rollen til vertssignalkomponenter og inflammatoriske mediatorer, i tillegg til cellen spesifikke interaksjoner som driver P. gingivalis -indusert immunopathology ^{12 - 14.} I tillegg, har eksperimenter som benytter definerte bakterielle mutanter identifisert kritisk P. gingivalis virulens faktorer som bidrar til kronisk betennelse på lokale og systemiske sider ^15.

Denne artikkelen detaljer metoder for vurdering av P. gingivalis -indusert kronisk betennelse på lokale og systemiske nettsteder. Vi gir en detaljert protokoll for analyse av alveolar bentap ved microCT hjelp Amira programvare. I tillegg definerer vi nytten av serie in vivo levende dyr MR for vurdering av progressiv iflammation innenfor innominate arterien. Vi inkluderer metoder for visualisering og kvantifisering av inflammatorisk plakk i arterielle lesjoner, og beskrive deres histologisk karakterisering. Bruken av transgene mus og definert bakterie mutanter gjør denne modellen spesielt egnet til å identifisere både vert og mikrobielle faktorer involvert i initiering, progresjon, og resultatet av sykdommen. I tillegg kan modellen brukes til å screene for nye terapeutiske strategier, inkludert vaksinering og farmakologisk intervensjon.

Protocol

1. Vekst og dyrking av bakterier

1. Streak frosset bestander av P. gingivalis 381 mot anaerobe blodagarplater og inkuberes i 3 - 5 dager i et anaerobt kammer (10% H _2/10% CO _2/80% N ₂₎ ved 37 ° C.
2. Bruk plate-organismene dyrkes for å inokulere 5 ml væskekulturer av hjerne hjerte infusjonsmedium (BHI) supplert med gjærekstrakt (0,5%), hemin (10 ug / ml), og menadion (1 pg / ml). Etter O / N vekst, overføre de 5 ml kulturer inn i 45 ml BHI.
3. Inkuber 50 ml flytende kulturer anaerobt for en additional18 - 24 timer og innhøsting på midten til slutten av log fase. MERK Purity av kulturen bør alltid verifiseres av Gram flekken før innføring av bakterier til dyr.
4. Høste bakteriene ved sentrifugering ved 7000 xg i 10 min. Aspirer supernatanten og resuspender grundig bakteriecellen pelleten i 5 ml PBS ved hjelp av en serologisk pipette. Legg til en ekstra45 ml PBS og sentrifuger ved 7000 xg i 10 min. Gjenta dette trinn to ganger for totalt tre vaskinger.
5. Etter den siste vask, cellepelleten suspenderes i PBS slik at en 1:10 fortynning av kulturen har en optisk tetthet på 1,0 ved 660 nm (en OD ₆₆₀ på 1 tilsvarer 10 ⁹ CFU / ml). Vei opp nok karboksymetylcellulose (middels viskositet) for å oppnå en 2% w / v-løsning (f.eks, 0,1 g per 5 ml kultur). Tilsett langsomt den karboksymetylcellulose til bakteriesuspensjonen mens virvling for å unngå klumpdannelse.

2. Oral Infeksjon

MERK: Som vist i figur 1, ved å bruke passende musemodellen og oral infeksjon diett, P. gingivalis induserer kronisk betennelse og immunpatologi på lokalt (munnhulen) og systemiske nettsteder (arteriene).

1. Administrer sulfametoksazol (0,87 mg / ml) og trimetoprim (0,17 mg / ml) (Sulfatrim) til seks-til 8-u-old hannmus ad libitum i deres drikkevann i 2 uker for å redusere den normale flora. Hold antibiotika løsning i brune glassflasker og beskytte den mot lys for å hindre nedbrytning.
2. For å unngå sedimentering av antibiotika løsning, riste flaskene en gang eller to ganger daglig (dvs. om morgenen og sent på ettermiddagen). Skift ut med en nylaget løsning hver 3 - 5 dager.
3. Etter to uker, erstatte antibiotika løsning med konvensjonell drikkevann. Tillate en 2-dagers antibiotika hvileperiode før oral smitte.
4. Laste P. gingivalis / fjæring i en 1 ml tuberkulin sprøyte med et vedlagt fôring nål. Manuelt holde musen ved å gripe Scruff på baksiden av halsen. Sikre grepet er fast nok til å begrense mobiliteten av musen hode.
5. Infisere mus ved lokal applikasjon av P. gingivalis ved bukkal overflaten av maxillae. Plasser fôring nål slik that er på linje med den buccale flaten av de riktige overkjevens jekslene og støte ut 50 pl av bakteriesuspensjonen. Disperse løsningen forsiktig langs gingiva i 1 min ved hjelp av ballen av forings nålen.
6. Tillat musen til å hvile i en periode på 30 sek 1 min før gjenta prosedyren på den venstre kjevebenet. Kontroll mus får antibiotikumet forbehandling og oral gavage med kjøretøyet alene (2% karboksy-metylcellulose i PBS).
7. For å undersøke patogen-indusert kronisk betennelse på lokale nettsteder indusert alveolar bentap ved å infisere mus tre ganger på to dagers mellomrom. Sacrifice mus seks uker senere for evaluering av bentap ved microCT.
8. For å undersøke patogen-indusert kronisk betennelse på lokale og systemiske nettsteder, infisere aterosklerose utsatt ApoE ^{- / -} mus fem ganger i uken i tre uker.
   MERK: Progresjon av sykdommen i innominate arterie overvåkes av serie in vivo MR. Bilde mus på ulike tidspunkter og ofre 6-16 wks sentr. På tidspunktet for offer, vurdere global aterosklerotisk byrden ved en face analyse og bestemme alveolar bentap ved microCT. Karakterisere aterosklerotiske lesjoner med histologi og immunhistokjemi.

3. Micro-computertomografi (microCT)

1. Prøve preparering
   1. Sacrifice mus på ønsket tidspunkt etter infeksjon. Avlive mus ved CO ₂ asphyxation eller av en annen metode godkjent av institusjonens dyret anlegget.
      MERK: samle blod ved hjertestans punktering, separat serum, og oppbevar ved -80 ° C for analyse av anti P.gingivalis IgG som beskrevet andre steder ^ni.
   2. Bruk en stor par halshogging saks til alvorlig musen hodet ved foten av skallen. Fjern kjøttet med en pinsett og plassere hodeskallen til et 50 ml konisk rør inneholdende 30 ml av 4% bufret paraformaldehyd. Fix prøven for 24 - 48 timer ved 4 ° C.
   3. Etter fiksering, Rinse prøven grundig med PBS.
   4. Lag overkjevens blokk biopsier.
   5. Oppbevar hemi-maxilla i histologisk grad 70% EtOH ved 4 ° C til evaluering av microCT.
2. Image Acquisition
   1. Utføre bilde oppkjøp ved hjelp av en stasjonær microCT skanner. Sett røntgenkilde til en strøm på 114 uA og en spenning på 70 kV. Laste individuell hemi-maxillae inn bilde fartøy og skanne ved oppløsning på 12 mikrometer i alle tre romlige dimensjoner.
      MERK: Legg i flere hemi-maxillae samtidig innenfor bildebehandling fartøyet.
   2. Utfør en foreløpig lav oppløsning skanning som gjør at brukeren kan avgrense grensene for bildeopptak og begrense skanning til regionen av interesse (ROI) ved hjelp av systemet.
      MERK: Intensiteten av emalje gjør kronen av overkjevens jeksler lett gjenkjennelig. Ved hjelp av jekslene som en guide løst Still bilde grenser til å omfatte de tre jeksler og det omliggende alveolar bone. Denne funksjonen blir også brukt til å diskriminere mellom individuelle hemi-maxillae ved skanning av flere prøver i samme kar.
   3. Når skanningen er fullført, konvertere RAW-bildefilene (.ISQ) i høy kvalitet dicoms (.DCM).
3. Bildeanalyse
   I denne protokollen, er bildeanalyse utført ved hjelp av en datavisualisering, bearbeiding og analyse programvare. Bruk først morfologiske landemerker for å lage en plan for best mulig passform for cementoenamel krysset (CEJ). Deretter bruker du til å forvandle hemi-maxilla inn i en standard orientering for etterfølgende måling av kjevebenet volum.
   1. Åpne programvaren og klikk "Åpne data"-ikonet i øverste venstre hjørne av bassenget. Alternativt kan du bruke File> Open Data.
   2. Velg DICOM bildestakk og klikk Last inn. DICOM Loader åpnes. Klikk på OK.
   3. Observere datasettet som et grønt ikon i bassenget. Legg merke til at å klikke på dataobjekt forårsaker ekstra, mentonn som skal vises i knappeområdet på toppen av bassenget. Velge ikonet fører også til litt informasjon om datasett som skal vises i egenskaps området.
   4. Hvert ikon i Pool gir en popup-meny der forskjellige moduler kan velges. Aktiver popup-menyen ved å klikke på den hvite pilen i høyre hjørne av data ikonet. Under skjermmodulen, velg Isosurface (Display> Isosurface). Den Isosurface ikon vil dukke opp i bassengområdet. Når dette er valgt, flere innstillinger vises i Properties-området.
   5. Sett Draw stil til gjennomsiktig og terskelen til 2000. Sørg for at den compactify og downsample knappene er valgt under alternativer. Under Gjennomsnittlig, sikre x, y og z alle satt til 2. Klikk Bruk for å generere isosurface.
      NB: Legg merke en gjennomsiktig 3D rekonstruksjon av hemi-maxilla i 3D-visningen. Fordelen med å bruke en gjennomsiktig uavgjort stil for bilde gjenoppbygging er at røttene til jekslene kanlett identifiseres. Dette vil være viktig når man setter at prøven er i standard orientering.
   6. Velg den grønne data ikonet og i Properties-området velger du ikonet avling. Observer et vindu med dimensjoner og koordinatene til dataene. Sett denne til side for nå. Legg merke til at en markeringsramme vises i 3D-visningen med grønne faner på hvert hjørne.
   7. Velg Interact knappen i visningsverktøylinjen. Endre størrelsen på markeringsrammen ved å klikke og dra på de grønne hjørner. Pass på at boksen omfatter regionen av interesse (ROI) og eliminerer så mye dead space og rusk som mulig. Dette vil redusere beregnings etterspørsel på datamaskinen.
   8. Bruk styrekulen knappen i visnings verktøylinjen for å rotere objektet i 3D-visningen sikre ROI er helt omfattet av markeringsrammen. Når du er fornøyd, klikker du på OK i avlingen vinduet satt til side i trinn 8.
   9. Velg data ikonet og under skjermmodulen velge Oblique Slice (OBS). (Display> OBS)
   10. Velg OBS. I egenskapsområdet, satt kartleggingen typen til lineær, datavinduet varierer fra -200 til 10.000, og prøvetaking til fineste. Nå velger rotere under Valg. Observere en roterings veksle i sentrum av OBS.
   11. Velg samhandle knappen i visnings verktøylinjen og bruker håndtakene på bryter for å justere klippeplanet stykket. Lag en sagittal plan som går parallelt med røttene av tennene og vinkelrett på den okklusale overflaten av tennene. Flyet skal gjennomskjære de tre jeksler (M1-M3) som illustrert i figur 2.
   12. Slå av roter og duplisere OBS (object> duplikat objekt). En ny ONS vises heter OBS 2. Slå på rotering på for OBS to.
   13. Bruk rotasjonshåndtaket for å reorientere OBS 2 slik at den er vinkelrett OBS 1 (se figur 2).
   14. Slå rotere off for OBS 2 og opprette tre dupliserte skiver. Disse vil bli nevne OBS 3, 4 og 5.
4. Plukke poeng på flyet av Best Fit
   MERK: Steps 3.4.1-3.4.5 beskriver plasseringen av 8 poeng langs CEJ skaper et fly av best mulig passform. Velg fire av de punkter fra sagittale stykker og de ​​andre fire fra koronale snitt (se figur 3). Når plukke poeng ligger på sagittal skiver i 3.4.6, kan det være nødvendig å justere OBS en.
   1. Juster OBS 1 med sentrum av den mest mesial rot M1 i sagittalplanet. Juster OBS 2 med sentrum av den mest mesial rot M1 i den koronale planet.
   2. Juster OBS 3 med sentrum av den distale bucco-roten av M1 i den koronale planet. Juster om nødvendig OBS 1 slik at det er tilnærmet sentrert med bucco-distal roten av M1 i Saggital planet ved valg poeng i trinn 20.
   3. Rett OBS 4 med furcation av kinn røtter M2. OBS 4 skal være sentrert mellom bucco-mesial og bucco-distal røtter M2. Juster om nødvendig OBS 1 slik at det er tilnærmet sentrert viddh den bucco-distal roten av M2 i sagittalplanet ved valg poeng i trinn 20
   4. Juster OBS 5, slik at det går nedover midten av M3 i den koronale flyet. Juster om nødvendig OBS 1 slik at det er tilnærmet sentrert med den mest distale roten av M3 i sagittalplanet ved valg poeng i trinn 20.
   5. Duplisere en av de OBSs (OBS 6) og velg skikket til punkter i egenskapsvinduet. Den passer til poeng veksle tillater forskeren å plukke tre eller flere poeng på 2D eller 3D-objekter innenfor betrakteren og deretter beregner et fly av best mulig passform. I dette tilfellet er 2D OBSs beskrevet i de foregående trinnene som brukes for å velge åtte punkter langs CEJ.
   6. Skjule OBS 6 fra 3D-visningen ved å klikke på den oransje boksen i høyre hjørne av data ikonet. Skjule isosurface fra 3D-visningen for å gjøre CEJ synlig på alle 2D-skiver. Skift-klikk og velg 8 poeng langs CEJ som beskrevet ovenfor.
      MERK: Hvis Skift-tasten ikke holdes nede når du velgerpunkter, vil et fly automatisk bli beregnet etter de tre første punktene.
   7. Når du har valgt alle 8 poeng, gjør OBS seks synlig. Merk at dette er et aksialt snitt som går omtrent parallelt med okklusal planet.
5. Transformasjon og Reorientering MERK: Flyet av best mulig passform brukes til å transformere dataene til en standard orientering for påfølgende volumetriske målinger.
   1. Klikk Data Ikon> Compute> ApplyTransform. Den ApplyTransform ikonet vises i bassengområdet. Klikk den hvite firkanten i hjørnet av ApplyTransform ikonet og velg referanse, og klikk på OBS seks.
   2. I Egenskaper-området, velger standard for interpoleringsmetode og utvidet for modus. Påfør transformasjon.
   3. Lag en isosurface og en koronale ONS for den nye datafilen. Roter ONS i aksial retning slik at den er omtrent vinkelrett med M1 (vist i figur 2). Bruk cusps av den molare og okklusal curvatures som en veiledning.
   4. Bruk dette flyet til å transformere dataene som i trinn 3.5.1 og 3.5.2. Lagre forvandlet datafil.
6. Segmentering og Bone Volume Måling
   MERK: Trinnene nedenfor beskriver segmentering og måling av kjevebenet. Den skive som tilsvarer planet for best passer for den CEJ er identifisert og et referanseplan som velges. Alveolar ben mellom CEJ og referanseplanet på bukkal forsiden av jekslene er segmentert og måles. Den mest mesial roten av M1 og den mest distale roten av M3 tjene som endepunkt landemerker. Innstilling av referanseplanet 15-20 skiver under CEJ gir optimale resultater. Inkludering av flere skiver introduserer variasjon som maskerer forskjeller i beinvolum blant behandlingsgruppene.
   1. Åpne Segmentering Editor og opprette en ny etikett for de transformerte data.
   2. Lag et nytt materiale og gi den navnet kjevebenet.
   3. Under Zoom og datavindu, sett dataområdet from -200 til 10.000.
   4. Under Display og Maske velge 2D trådkors, 3D MPR og 3D volumrende ikoner. Sett dataområdet fra 2500 til 8000. Aktiver data maskering.
   5. Velg Fire Seerne skjerminnstilling fra betrakteren verktøylinjen. Skjermen er delt opp i fire kvadranter som tillater samtidig undersøkelse av Saggital, koronal og aksial bildestakker, samt 3D gjengitt volum.
   6. Bruk alle fire kvadranter å identifisere det siste stykket der emaljen er synlig på kinn ansiktene til M1 og M3. Denne plasseringen tilsvarer planet passer best for CEJ. Noter aksial skive nummer.
   7. I aksialplanet, fortsetter 15-20 skiver mot kjevebenet crest. Dette representerer referanseplanet.
   8. Bruk hvilken som helst kombinasjon av segmenteringsverktøy for å velge alveolar ben på bukkal forsiden av jekslene mellom CEJ og referanseplanet. Bruk mest mesial roten av M1 og den mest distale roten av M3 som landemerker endepunkt.
   9. Gå tilbake til objekt basseng. Et nytt ikon med utvidelsen ".Labels" bør legges til bildedata ikonet. Velg Etiketter ikonet og i rullemenyen velger Materialer> MaterialStatistics.
   10. I egenskapsområdet velger Material og traff gjelder. En tabell vises med flere parametere for hvert materiale i listen over materialer. Spill volumet av kjevebenet.

4. Vurdering av Åreforkalkning

1. Aortadisseksjon
   1. Ofre musen ved CO ₂ kvelning på ønsket tidspunkt etter infeksjon.
   2. Plasser musen på dorsal side, tape ned og tørk mus med 70% EtOH. Kutt huden på ventral side fra midten av magen til like over xyphoid prosessen.
   3. Skjær magehuden til xyphoid prosessen er synlig. Løft xyphoid prosessen med en liten pair av tang, gjøre kutt på hver side av brystkassen, og kutte mellomgulvet. Deretter gjøre to kutt ned hver side av brystkassen for å blottlegge hjertet.
   4. Exsanguinate musen ved hjelp av en 27 G insulinsprøyte plassert inn i toppen av den høyre ventrikkel. Under blodsamling, periodisk dreie nålen for å forhindre blokkering av åpningen ved den ventrikulære veggen. Vanligvis er 0,8 - kan 1 ml blod oppnås ved hjelp av denne metoden.
   5. sup> MERK: Separat serum og oppbevar ved -80 ° C for analyse av anti P.gingivalis IgG som beskrevet andre steder ⁹
   6. Bruk saks for å fjerne høyre atrium.
   7. Finn den venstre ventrikkel på bakre side av hjertet. Innføre en 21 G nål inn i toppen av venstre ventrikkel, med skråkant av nålen som vender mot midten av kammeret og langsomt spyle sirkulasjonssystem med 3 - 5 ml av vev fiksativ.
   8. Trim fett og thymus rundt hjertet.
   9. Fjern luNGS.
   10. Finn aortabuen med de tre grener og fjerne omliggende fett lag for bedre eksponering.
   11. Fortsett disseksjon av aorta fra buen til undersiden av membranen.
   12. Fjern leveren og fortrenge tarmvevet for å eksponere den nedstigende aorta. Dissekere distale aorta ned til nyrearterien grener.
   13. Skjær nyrearteriene og fortsette disseksjon ned til ileal delinger.
   14. Når aorta er fri for de fleste bindevev, tilbake til toppen av aorta og snip den aller øverste delen av de tre grener av aorta over hjertet.
   15. Peel hjerte oppover, snipping underliggende fettvev for å skille hjerte fra kroppen.
   16. Hold hjertet med pinsett og dra oppover, kutte bindevevet som kan fortsatt være festet, og fortsetter ned til nyrene og følg ned til bena og klipp på laveste punkt mulig.
   17. Fix aorta i 10% Formalin for 1 time med en subsefølgende PBS vask for 1t. Alternativt, lagre aorta i 10% Formalin O / N, skyll i PBS neste dag og fortsette med disseksjon.
   18. Plasser aorta inn i en 10 cm petriskål som inneholder PBS.
   19. Ved hjelp av en dissekere omfang, fjerner du forsiktig adventitial vev fra aorta.
   20. Når aorta er fri for overflødig fett og vev, avskåret to nederste tredjedeler av hjertet. Begynn peeling hjertemuskelen bort ved slutten av hjertet motsatt av aortabuen. Pæren av aorta bør langsomt ut, noe som vil være hvit i farge.
   21. Fortsett forsiktig disseksjon med to pinsett til aorta pærer er fri for hjerte muskelvev.
   22. Plasser renset aorta inn i en svart dissekere brett og dekk med PBS.
2. Låsing av Aorta
   1. Hold aorta dekket i PBS gjennom låsing.
   2. Lå aorta i anatomisk stilling med pærer av aorta på venstre.
   3. Plasser midlertidige minutien pins på fem steder som starter på 1) toppen av aorta, 2) under tredjegren av buen, 3) midtveis av synkende aorta 4) nær nedre enden av synkende aorta 5) over grenen av lårarteriens.
   4. Ved hjelp av ekstra fine våren saks, kuttet opp venstre side av aorta, som starter på venstre grenen av lårarterie hele veien opp til aorta til under laveste grenen av aorta ascendens.
   5. Klipp fra mot venstre side av laveste aortic pære på sprekken og fortsett kutt for å nå krysset av kutt langs vertikale kutt av aorta.
   6. Skjær over aorta horisontalt for å nå poenget med laveste grenen av aorta ascendens
   7. Kutt opp på høyre side ovenfor høyeste grenen av aorta.
   8. Skjær hver gren å eksponere sin indre overflate.
   9. Fjern noe av midlertidige pins og erstatte med permanente pins med mål om låsing ned all aorta i anatomisk sted uten folding, strekking av aorta. Målet er å eksponere indre overflaten av aorta.
   10. Fortsett låsing inntil alt indre overflate av aorta blir eksponert og lett synlig ovenfra, og fri for visuell interference fra nålene.
3. Lipid Flekker og lesjon Kvantifisering
   1. Forbered Sudan IV farging oppløsning (5 mg / ml i 70% isopropanol). Bland godt og filtrer for å sikre at ingen krystaller er til stede.
   2. Cover låste aorta i Sudan IV løsning for 50 min.
   3. Vask med 70% isopropanol til 1 - 5 min. Forsiktig skylle aorta med ddH20 før vannet kommer av aorta er ikke lenger rødt.
   4. Dekk aorta med PBS. Ta bilder av aorta med et høyoppløselig kamera koblet til en dissekere mikroskop og lagre som digitale bildefiler (TIFF). Plasser en linjal ved siden av hvert bilde for å bistå i kalibrering.
   5. Bruk ImageJ programvare for å bestemme området av intima og areal av lesjoner. Manuelt spore den indre overflate for å bestemme området. Lesjonsområdet kan beregnes ved hjelp av automatisert farge thresholding. Dette krever å sette en terskel for å definere en farge intensitet som diskriminerer lesjoner fra normale områder.
   6. Beregne hvor stor andel avintimale overflate dekket av aterosklerotiske lesjoner.

5. Histologisk Vurdering av aterosklerotiske lesjoner

1. Høste aortabuen med hjertevevet og legg de i oktober i en disponibel basen mold.
2. Samle fem mikrometer serie cryosections hver 50 mikrometer i aorta sinus og innominate arterien ved hjelp av en kryostat satt til -17 ° C og montere vevssnitt på objektglass. Butikken lysbilder ved -20 ° C inntil videre bruk.
3. For histologiske undersøkelser, flekken med hematoksylin & eosin bruke de riktige prosedyrer.

6. Immunhistokjemisk karakterisering av aterosklerotiske lesjoner.

Trinnene nedenfor skisserer en generell antistoff-basert protokoll rutinemessig ansatt for å vurdere aterosklerotiske lesjoner i P. gingivalis -infected mus. Denne protokollen krever optimalisering for hvert antistoff eller reagens.

1. Fjern lysbilder fra fryseren og fiksei 2 min i is-kald fiksativ (aceton eller annet fikseringsmiddel).
2. Tillat lysbilder til å komme til RT og merke med en løsemiddelbestandig penn.
3. Skyll glir 3x i PBS for å fjerne vev-frysing matrise
4. Blokker endogen peroksidase-aktivitet ved inkubering av lysbildene i 0,3% H ₂ O ₂ løsning i PBS i 10 min.
5. Skyll glir 3x i PBS i 2 min hver gang.
6. Blokker ikke-spesifikk binding ved inkubering i blokkering buffer (10% kaninserum i PBS) i 30 min ved RT.
7. Fortynn det primære antistoff 01:50 i 10% kaninserum.
8. Påfør fortynnet antistoff til vevsdelene på lysbildet.
9. Inkuber i 1 time ved RT.
10. Skyll glir 3x i PBS i 2 minutter hver.
11. Fortynnet anti-rotte biotinylert sekundært antistoff 1: 100 i 10% kaninserum.
12. Bruk for å vevsdelene på lysbildet og inkuberes i 30 min ved RT.
13. Skyll glir 3x i PBS i 2 minutter hver.
14. Forbered DAB substrat løsning ved å legge1 dråpe DAB kromogenløsningen til hver 1 ml DAB buffer.
15. Renne PBS fra lysbildene og bruke DAB underlaget løsning. Tillat lysbilder å inkubere i 5 minutter, eller inntil den ønskede fargeintensitet er nådd.
16. Vask 3 x i vann i 2 minutter hver.
17. Counter flekken med hematoksylin.
18. Dehydrerer gjennom fire endringer av alkohol (95% 1 min, 95% 1 min, 100% 1 min og 100% 5 min).
19. Klart i tre med xylen.
20. Dekkglass ved hjelp av monteringsløsning og analysere kvalitativt ved mikroskopi. For kvantitativ analyse, hente bilder og beregne farging område med ImageJ bruker en automatisert terskel.

7. MR

1. Animal Forberedelse til MR
   1. Anesthetize mus før MR eksperimenter. Utfør den innledende induksjon av anestesi ved anvendelse av 4% fordampede isofluorane i 2-3 min i en induksjonskammeret. Opprettholde anestesi under bilde periode ved hjelp av en kontinuerlig strøm på 0,5 - 2% fordampet isofluorane delid gjennom en nese kjegle oppsett eller maske.
   2. Etter å ha nådd den kirurgiske planet av anestesi (det vil si ingen tå klype respons), plasseres musen i en dyreholderen med sin nese inn i en nesepartiet. Det finnes flere typer av kommersielt tilgjengelige dyre holdere som kan brukes for å minimalisere potensiell bevegelse under avbildning. Vi bruker en spesialdesignet holder med en bit bar.
   3. Overvåk åndedrett og hjertesyklus og synkronisere med bildeopptak ved hjelp av et åndedrett pute (plassert på musens abdomen) er utstyrt med et lite dyr overvåking og gating system.
   4. Fest musen og overvåkingssystem på dyret holder med laboratorie film.
2. MR datainnsamling
   1. Plasser dyret holder med musens hodet først i liggende stilling inn i en 30 mm vertikal probe (Micro 2,5) holdt ved 23 ° C, og inn i den vertikale boring 11.7 T MR-skanner.
   2. Juster holderen med sentrum av than RF-spole.
   3. Gjennomføre en shimsingen prosessen ved hjelp av en enkelt puls sekvens.
   4. Ved hjelp av en RARE sekvens, erverve speiderbilder langs tre ortogonale retninger for å skape aksiale, koronale og sagittal bilder.
   5. Utfør en lav oppløsning Magnetic Resonance angiografi (MRA) med en ungated 3D gradient ekko sekvens med følgende parametre: dekketykkelse = 1,5 cm; flip vinkel = 45 °; repetisjon gang = 20 ms; echo time = 2.2 ms; synsfelt = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; matrix = 64 × 64 × 64; antall gjennomsnittlig = 1. Total Scan: 2~3 min. Hensikten med dette scan er å sikre at bildene blir ervervet ved målområdet (den innominate arterie).
   6. Utfør en høy oppløsning MRA av innominate arterie med en ungated 3D gradient ekko sekvens med følgende parametere: dekketykkelse = 1,5 cm; flip vinkel = 45 °; repetisjon gang = 20 ms; echo time = 2.2 ms; synsfelt = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; matrix = 128 &# 215; 128 × 128; antall gjennomsnittlig = 4. Total scan tid var omtrent 25 min.
   7. Få kontinuerlige aksiale bilder av innominate arterie 0.5mm under subclavia delinger.
3. MR dataanalyse
   1. Utfør image rekonstruksjon og analyse ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer knyttet til skanneren. Oppnå 3D-rekonstruksjon av MRA bilder ved maksimal intensitet Projection.
   2. Bruk subclavia delinger som en anatomisk markør for å justere data innhentet fra forskjellige mus eller samme mus ved ulike tidspunkt. Velge målet tverrsnitt av innominate arterien på 0.3- til 0,5 mm avstand under subclavianbifurcation.
   3. Definere og beregne luminal område av valgt tverrsnitt med ImageJ. Målingene skal utføres på en blindet måte av to uavhengige observatører. Bekreft måling reproduserbarhet ved å beregne interclass korrelasjonskoeffisienter.
   4. For longitudinelle studier med serie imaging, normal luminal område til området av hulrommet oppnådd ved start (det første kan i studien) for hver mus. Uttrykke resultatene som endring i luminal området over tid.
   5. Utføre de riktige statistiske analyser (dvs. student t-test) for å finne signifikante forskjeller mellom eksperimentgrupper.

Representative Results

Bruke riktig musemodell og oral smitte regime, P. gingivalis induserer kronisk betennelse og immunpatologi på lokalt (munnhulen) og systemiske nettsteder (arterier) (figur 1).

Hos mus oral infeksjon med P. gingivalis induserer en lokal betennelsesreaksjon som driver ødeleggelse av tann støtte alveolar bein ^åtte. P. gingivalis -infected mus utvikler serumantistoffresponsen til denne organisme som er hovedsakelig av IgG-isotype ^9. Resultatene er vist i figur 4 er representative for et eksperiment der C57BL / 6 var infisert med P.gingivalis tre ganger på to dagers intervaller og ofret seks uker senere for vurdering av alveolar bentap ved microCT. Volumetrisk analyse med Amira programvare avslører at P. gingivalis -infected mus utviser signifikant bentap sammenlignet med ikke-infiserte kontroller (figur 4A). Visuell inspeksjon av rekonstruerte hemi-maxillae illustrerer en økning i eksponerte overflateareal av de molare røtter i infiserte mus i forhold til kontroller (figur 4B og figur 4C).

I aterosklerose utsatt APOE ^{- / -} mus, P. gingivalis induserer kronisk betennelse som driver alveolar bentap ¹² og inflammatorisk avleiring i aorta sinus ¹⁵ og innominate arterie ^11. P. gingivalis indusert aterosklerose inntreffer så tidlig som 24 timer etter den siste infeksjon og kan forhindres ved immunisering før infeksjon ^16. Progressive betennelse i innominate lunge P. gingivalis -infected mus kan overvåkes i levende mus ved serie in vivo MR ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon (figur 5). en Face målinger av Sudan IV farget aortas viser at P. gingivalisinfeksjon i betydelig grad øker lipid avsetning og angrepne område på intimale overflate (figur 6). Ved tidspunktet for avlivelse, histologi og immunohistokjemi kan brukes til å kvalitativt eller kvantitativt å karakterisere aterosklerotiske lesjoner i forbindelse med cellulære sammensetning, ekspresjonen av forskjellige antigener, og lipid-innhold. Immunhistokjemisk analyse av aorta sinus lesjoner avslører økt makrofag infiltrasjon og forhøyet uttrykk av det medfødte immun reseptor Toll-like receptor 2 (TLR2) i P. gingivalis -infected mus (figur 7).

Figur 1. P. gingivalis -indusert kronisk betennelse på lokale og systemiske nettsteder. Før infeksjon med P. gingivalis mus er administe rødt antibiotika ad libitum i deres drikkevann i 10-14 dager etterfulgt av en to-dagers antibiotikum hvileperiode. Antibiotikabehandling undertrykker de innfødte muntlige flora og letter kolonisering. For induksjon av alveolar tap, blir musene infisert tre ganger ved to-dagers intervaller og alveolar benet volum måles 6 uker etter infeksjon. Ved vurdering av aterosklerose, åreforkalkning utsatt ApoE ^{- / -} mus er vanligvis smittet fem ganger i uken i tre uker, og ofret 16-24 uker etter smitte. Progressiv betennelse i innominate arterie av levende mus kan måles ved serie in vivo MRI ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon. Histologi og immunohistokjemi kan brukes til å sette flekker på lipider og inflammatoriske celler ved avslutning av forsøket for å validere avbildningsdata. På tidspunktet for offer, er alveolar bentap målt ved microCT og global aterosklerotisk byrde er vurdert av en face farging av hele aortas. https://www.jove.com/files/ftp_upload/51556/51556fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Mouse hemi-maxilla illustrerer plassering av OBS 1 og OBS 2. De tre jeksler er merket (M1-M3) og relevant anatomisk terminologi indikeres. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Mus hemi-kjeve som illustrerer plasseringen av OBS 1 til 5.1556 / 51556fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Alveolar bentap målt ved microCT. Mann C57BL / 6 ble muntlig infisert med P. gingivalis eller kjøretøy alene (infisert) og kjevebenet volumet ble evaluert av microCT 6 uker senere ved hjelp av Amira. (A) Alveolar bein volum i hemi-maxillae fra infisert og P. gingivalis -infected C57BL / 6. Resultatene representerer benvolum over referanseplanet (120 mikron fra den CEJ). Dataene er uttrykt som benvolum SD fra n = 8 mus per gruppe. *** P <0,001 sammenlignet med ikke-infiserte kontroller. (B) og (C) Representative 3D rekonstruksjoner av hemi-maxillae fra uinfisert (B)og P. gingivalis -infected (C) mus. En signifikant reduksjon i alveolar benvolum kan sees i P. gingivalis -infected mus sammenlignet med ikke-infiserte kontroller. Pilspisser indikerer områder hvor synlig bentap oppstår i P. gingivalis -infected mus (merk økningen i eksponerte overflaten av molar røtter). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Progressive betennelse i innominate arterie følgende P. gingivalis infeksjon målt ved MRI (A) Representant magnetisk resonans (MR) angiografi av aortabuen og store fartøy av en ApoE. ^-/ -. Mus (B) Axial MR-bilde fra den gule linjen i A i innominate arterien til en mus, 0.3mm under sitt delinger. Innominate arterier ble fotografert av MRA ved baseline og ved 12 og 16 wk post-infeksjon. (C) Den tidsmessige endringen i luminal område (mm ²⁾ ble beregnet for individuell mus (n = 10-12 / gruppe). Usmittede ApoE ^{- / -} (blå), P. gingivalis -infected ApoE ^{- / -.} (rød) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. En ansikts bestemmelse av angrepne området i hele aorta. (A) Sudan IV farging av aorta <em> en face lesjoner 16 wk etter infeksjon med P. gingivalis. (B) Kvantifisering av lipid-innhold innen det totale aorta av ikke-infiserte (hvite symboler) og P. gingivalis -infected mus (svarte symboler) (n = 10-13 / gruppe). Prosent av aorta okkupert av lipider ble beregnet ved hjelp ImageJ. * P <0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. Immunhistokjemisk analyse av aorta sinus lesjoner Mann ApoE ^{-. / -} Mus matet en normal chow diett var infisert med P. gingivalis eller infisert og ofret 16 uker etter infeksjon. Cryosections innhentet fra aorta sinus var farget med antimus F4 / 80 og TLR2. Scale bar, 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

The P. gingivalis oral smitte modellen gir et verdifullt verktøy for studier av patogen-indusert kronisk betennelse på lokale og systemiske nettsteder. Denne unike modellen tillater karakterisering av både vert og patogen spesifikke mekanismer som bidrar til kronisk betennelse og immunpatologi. I tillegg, kan modellen benyttes for å screene for nye terapeutiske strategier, f.eks immunisering og farmakologisk intervensjon. Trinnene som er beskrevet i denne protokollen beskriver vellykket bruk av denne modellen og detalj metoder for å vurdere initiering, progresjon, og utfallet av P. gingivalis -indusert kronisk betennelse.

Det er flere viktige aspekter å huske på når du bruker denne protokollen for å undersøke inflammatorisk bentap. For det første bør det bemerkes at resultatet av infeksjon med P. gingivalis bestemmes av tre viktige faktorer: 1) genetisk mottakelighet til verten for smitte 2) patogenvirulens (genetikk av patogenet), og 3) den resulterende verts-patogen interaksjon (interaksjonen av de to genomer). Mottakelighet for P. gingivalis -indusert alveolar bentap er genetisk bestemt hos mus, og dermed må man være forsiktig når du velger belastningen av mus for studie ^17. Differensialverts svar blant innavlede stammer av mus kan bli utnyttet til å gjennomføre frem genetiske skjermer og karakterisere gener involvert i mottakelige og motstand mot patogen-indusert kronisk betennelse. I tillegg eksisterer en betydelig heterogenitet i evnen til forskjellige P. gingivalis stammer å indusere alveolar bentap hos mus ^18. Denne protokollen bruker mus på C57BL / 6 bakgrunnen på grunn av tilgjengeligheten av transgene mus og deres følsomhet for aterosklerose. P. gingivalis belastning 381 induserer alveolar bentap og atherosclerosis i mus på C57BL / 6 bakgrunn, og flere bakterie mutanter har blitt utviklet ved hjelp this belastning.

Mus er spesielt motstandsdyktig mot aterosklerose og utvikling av åpenlys arterielle lesjoner krever bruk av genetisk modifiserte musemodeller av aterosklerose. Vi bruker ApoE ^{- / -} mus modell fordi det er veletablert musemodell av aterosklerose, ikke krever fôring av høy fett kosthold for lesjon formasjonen, og rekapitulerer mange aspekter av menneskelig sykdom ^19. Den type kosthold for å mate dyr i løpet av forsøket er en viktig variabel. For de fleste av vårt arbeid, mate vi mus en normal chow kosthold for å unngå bidrag av eksogene lipider i tolkningen av våre resultater. I innledende studier, fant vi at fôring mus med høyt fettinnhold masker forskjeller i eget ansikt lesjonsområdet mellom infisert og P. gingivalis -infected mus i aorta sinus. Men, høy fett kosthold og P. gingivalis infeksjon arbeid synergi når progresjon av inflammasjon overvåkes i innominate ved MR eller histologi ^11. I mus har de innominate arterie en høy grad av lesjon progresjon, og lesjoner i denne arterie uttrykkelig har karakteristisk for klinisk sykdom hos mennesker, inkludert fartøy innsnevring, atrofisk medier, perivaskulær inflammasjon, og plakk avbrudd. Forskjeller i den cellulære sammensetningen av lesjoner er tydelig på ulike anatomiske områder. Makrofager er de primære immunceller infiltrere aorta sinus lesjoner, mens innominate Arteria lesjoner er sammensatt av både makrofager og T-celler.

Eksperimentell varighet og tidspunktet hvor provoserende endepunkter evalueres er flere faktorer å vurdere når man vurderer initiering, progresjon, og utfallet av P. gingivalis -indusert aterosklerose. Vi har tidligere vist at P. gingivalis -infected ApoE ^{- / -} mus utviser makrofag infiltrasjon, opphøyet uttrykk for medfødte immunmarkører, ennd økt avsetning av inflammatorisk plakk så tidlig som 24 timer etter den siste infeksjon i aorta sinus og dette kan forhindres ved immunisering ^16. I våre hender, betennelser og immunpatologi øker med stigende alder, og er tydelig i opptil 24 uker etter infeksjon. Imidlertid avgjørelser vedrørende varigheten av studien til slutt avhengig av den underliggende hypotese som studeres, modusen for analyse og tidligere kjennskap til den grad av aterosklerose under bestemte forhold i omgivelsene.

Bruken av ikke-invasive avbildningsteknikker for å overvåke progressiv betennelse i innominate arterien kan brukes til å lede forsøksvarighet. Serie MR åpner for detaljerte studier av aterosklerose progresjon i samme dyr som kan skildre innsnevring av arterielle lumen og små åreveggen områder ^20. I motsetning til tradisjonelle metoder, som for eksempel lipid farging av dissekert fartøy, betyr MR avbildning krever ikke eutanasiog gir mulighet for longitudinelle studier for å vurdere initiering og progresjon av aterosklerose. I forbindelse med transgene mus, bakterielle mutanter eller eksperimentell behandling, kan den tidsmessige informasjon gitt av MRI brukes til å evaluere effekten av verts genetikk, patogen virulensfaktorer, og terapeutisk intervensjon. Som en ekstra fordel, histologi og immunohistokjemi kan brukes til å sette flekker på lipider og inflammatoriske celler ved avslutning av forsøket for å validere avbildningsdata. Vi har nylig brukt disse metodene for å demonstrere at oral infeksjon med P. gingivalis akselererer aterosklerose i innominate arterties av ApoE ^{- / -} mus, at immunisering gir beskyttelse mot plakk progresjon, og korrelerer med reduksjon i akkumulering av lipider og betennelsesceller ^11.

I sammendrag, skisserer denne protokollen trinnene som kreves for å frembringe en robust modell av patogen-indusert kronisk betennelse, samtsom de metoder som brukes for å vurdere betennelse på lokale og systemiske nettsteder. Bortsett fra å bruke denne modellen for å undersøke vert og patogen spesifikke mekanismer som er involvert i inflammatoriske bentap og aterosklerose, kan den tilpasses for å studere bidraget av patogen-indusert kronisk betennelse i ytterligere sykdomsmodeller. Dette kan oppnås ved hjelp av transgene musemodeller av sykdom, inkludert reumatoid artritt, diabetes, og kreft. Emerging bevis indikerer at en rekke kroniske sykdommer med ukjent etiologi kan ha smittsomme opprinnelse. Disse sykdommene inkluderer neoplastisk, autoimmune, og inflammatorisk sykdom, og sammen kompromiss de viktigste årsakene til sykelighet og dødelighet på verdensbasis. Således har bruken av dyremodeller for å undersøke rollen av patogener i sykdommer drevet av kronisk betennelse potensialet for bred terapeutisk virkning og forbedret diagnostikk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
Rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 dissecting scope	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm