The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.
O passarinho de zebra (Taeniopygia guttata) tornou-se um modelo cada vez mais importante organismo em muitas áreas de pesquisa, incluindo toxicologia 1, 2, 3 comportamento e memória e aprendizagem 4,5,6. Como a única ave canora com um genoma seqüenciado, o tentilhão tem um grande potencial para o uso em estudos de desenvolvimento; No entanto, as fases iniciais de desenvolvimento da zebra Finch não ter sido bem estudado. A falta de pesquisa em desenvolvimento Finch zebra pode ser atribuída à dificuldade de dissecção do ovo pequeno e embrião. O seguinte método de dissecação minimiza os danos do tecido embrionário, o que permite a investigação da morfologia e a expressão do gene em todos os estádios de desenvolvimento embrionário. Isto permite que ambos campo brilhante e as imagens de embriões qualidade de fluorescência, a utilização em procedimentos moleculares, tais como hibridação in situ (ISH), ensaios de proliferação celular, e a extracção de ARN para ensaios quantitativos, tais como rea quantitatival-time PCR (qtRT-PCR). Esta técnica permite que os investigadores a estudar estágios iniciais de desenvolvimento que antes eram de difícil acesso.
O objetivo geral desta técnica é obter zebra Finch (Taeniopygia guttata) embriões desde os primeiros estágios da embriogênese para uso em uma ampla gama de estudos de desenvolvimento. Passarinho de zebra tornaram-se o modelo predominante songbird organismo e têm sido amplamente utilizados em uma variedade de campos, incluindo toxicologia 1,2, 3 comportamento, memória e aprendizagem 4,5,6, neuroanatomia comparativa 7,8 e desenvolvimento da linguagem 9,10 . Como a única ave canora com um genoma seqüenciado, o tentilhão permite o estudo molecular e genética da ordem Passeriformes, o que representa mais de 50% das espécies de aves conhecidas 11, 12,13.
Apesar do uso de adulto e tentilhão juvenil em uma diversificada gama de campos, poucos estudos foram realizados em embriões zebra passarinho, especialmente durante os estágios iniciais de desenvolvimento. Isto pode ser atribuído ao tamanho pequeno do seu ovos umª embriões, e seu status como uma nova 14,15,16 organismo modelo para estudos em que o frango (Gallus gallus domesticus) já foi usado como um sistema de 17,18,19,20,21 modelo predominante. No entanto, como os alunos não-vocais, as galinhas não são um sistema modelo adequado para estudar a base genética da aprendizagem vocal, desenvolvimento da aprendizagem vocal, herdabilidade, comportamento, eo circuito córtico-basal gânglios envolvidos na aprendizagem de motor 10.
É importante notar que os embriões zebra passarinho são muito mais delicada e mais facilmente danificadas do que embriões de galinha durante a dissecção e procedimentos moleculares. Em particular, o maior cuidado é necessário ao executar passos permeabilização de embriões passarinho de zebra. Detergentes fortes e enzimas que não iria prejudicar um embrião de galinha pode danificar embriões passarinho de zebra. Em termos de cuidados gerais, é necessário colocar ovos passarinho de zebra em pequenos copos antes da colocação em uma incubadorapara evitar que se quebre rolando durante a incubação.
Passarinho de zebra são passíveis de estudos comportamentais, de forma fácil e prolífica raça durante todo o ano em cativeiro, e são aprendizes vocais. Estas características permitem o uso de passarinho de zebra para atender à necessidade de um organismo modelo que integra o desenvolvimento, genética e aspectos comportamentais da linguagem. Os métodos de dissecções detalhadas abaixo, combinadas com um guia de preparação desenvolvido recentemente específico para zebra finch 22, fazer o tentilhão um modelo de desenvolvimento padronizado organismo cada vez mais útil. No entanto, a obtenção de embriões em estágios iniciais pode ser assustador. Este protocolo permite aos investigadores obter facilmente embriões em fase inicial. Estudos que investigam o desenvolvimento inicial ea base molecular do desenvolvimento de comportamentos complexos em zebra passarinho, ou os efeitos toxicológicos de desenvolvimento em outros pequenos, aves passeriformes vai encontrar esta metodologia dissecção útil.
O recente desenvolvimento de um guia de preparo embrionário 22 e anotação do genoma fazer o tentilhão um organismo modelo para estudos de desenvolvimento desejável. No entanto, o pequeno tamanho e fragilidade dos embriões zebra passarinho, que variam entre 3 e 7 mm de estágios 1 – 10 22, pode tornar difícil dissecções 11, 14. Localizando e de forma limpa retirar embriões a partir da superfície da gema pode ser um desafio. Este protocolo fornece detalhes suficientes para realizar o procedimento com facilidade. Este protocolo demonstra as etapas críticas que não são tipicamente conhecidos, mas são necessárias para garantir uma dissecção de sucesso. Por exemplo, é essencial para deixar uma pequena camada de gema de entre o embrião e a folha de papel de pesagem para evitar que adere.
Tanto a identificação e remoção do embrião pode ser difícil. Para solucionar a identificação do embrião sobre a superfície da gema, brilho de luz directamente por cima da gema após temfoi removido do ovo, e olhar para a gema de um ângulo de 45 ° para encontrar o embrião. Uma vez que o embrião está localizado, a gema de corte em peso de papel, tendo o cuidado de não destruir o embrião.
Se outras aplicações incluem imagiologia por diferenças anatómicas, hibridação in situ, ou de ensaios de proliferação celular, é importante remover a membrana vitelina em fase 1-8 22 para uma melhor visualização das estruturas. Se passando por dificuldades ao remover a gema ou a membrana vitelina em estágios iniciais, fixe o embrião em PFA 4% antes de lavá-lo em 1X PBS para reduzir a fragilidade embrionário. Ao primeiro remover a membrana vitelina durante a dissecção, como descrito, as estruturas são claramente visíveis e intacto em embriões tentilhão após a realização de uma hibridização in situ.
Uma limitação do Edu é que a administração de volumes de dosagem sobre 478 ligações nl a fatalidade embrionário. No entanto, a vasta gama de dosagem permite varyinníveis de g de marcação de proliferação celular.
A reação "click" utilizado neste kit é o de cobre (I)-catalisada por Alcino-Azida-cicloadição (Cu (I) AAC). Nesta reacção especifica, uma molécula de análogo da timidina contendo alcino (EdU) é constituída por células em divisão activa. O grupo alcino no EdU se projecta a partir da estrutura helicoidal do ADN, e é detectada pela exposição a uma molécula de azida conjugado com uma molécula de verde, fluorescente que se liga ao grupo alcino livre. A fluorescência verde indica que as células em proliferação recentemente no embrião. A bio-ortogonalidade da azida e os grupos alcino impede a coloração não específica, porque estas espécies reactivas não estão naturalmente presentes nos organismos. Além disso, porque o ADN não necessita de ser desnaturado de modo a que a reacção ocorra, uma análise posterior dependente de DNA podem ser facilmente realizados 27.
Uma limitação inerente do método é o tamanho pequeno e fragility de embriões passarinho de zebra. Retirar a membrana vitelina de embriões encena 1-15 22 pode resultar em estruturas embrionárias prejudiciais se não for realizado com cautela. No entanto, este protocolo simplifica o método de dissecação, permitindo aos investigadores utilizar estágios embrionários iniciais para analisar anomalias estruturais e expressão de genes que não foram anteriormente estudadas em profundidade. Este protocolo abre o caminho para uma infinidade de ensaios celulares-molecular que permitirá que os investigadores a determinar as origens do desenvolvimento de fenótipos adultos. Por exemplo, será possível analisar a expressão de genes implicados na aprendizagem vocal sob diversas condições ambientais ou após tratamentos farmacológicos nas primeiras fases de desenvolvimento 28, 29,30,31. Apesar de não demonstrado neste trabalho, este método potencialmente permite a outros procedimentos, como radioativa em hibridização in situ em cortes de tecidos passarinho de zebra e eletroporação / de ovo Cirurgia 32, 33,34. Dado que o tentilhão foi estabelecida como um organismo modelo importante dentro de um vasto corpo de literatura, esses estudos fornecem oportunidades inexploradas para ligar mecanismos de desenvolvimento com a fisiologia eo comportamento adulto, em especial, o desenvolvimento da linguagem 7, 9.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem as suas fontes de financiamento, do Instituto Médico Howard Hughes Programa de Educação de Graduação Ciência da College of William and Mary; Patrocinador Grant: NIH (MSS); Número Grant: R15NS067566. Eles também reconhecem o apoio do College of William and Mary, do Departamento de Biologia e Faculdade de Artes e Ciências de assistência com cuidados com os animais.
Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
Ethanol (EtOH) | |||
50mL Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
Modeling Clay | Any brand | ||
Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20 | |||
35mL Plastic petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
plastic wrap | Any brand | ||
Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Reaction Mix: 875μL 1xPBS, 100mM 20μL CuSO4 (Kit Component E), 5μL Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100μL diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
sdd H2O | |||
Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
Stainless steel scalpel | |||
Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
4×4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |