Isolatie van Neonatale Extrahepatisch cholangiocyten
Summary
Een techniek om cholangiocyten isoleren van de extrahepatische galwegen van neonatale muizen wordt beschreven. De kanalen zijn zorgvuldig ontleed en vervolgens cellen worden geïsoleerd door uitgroei in dikke collageen gels. Deze methode biedt een nuttig instrument voor het bestuderen van extrahepatische galwegen ontwikkeling en pathologie.
Abstract
De intra-en extrahepatische galwegen van de lever zijn ontwikkelingsgebied onderscheiden, en kan verschillend worden beïnvloed door bepaalde ziekten. De verschillen tussen intra-en extrahepatische cholangiocyten en tussen neonatale en volwassen cellen, zijn niet goed begrepen.
Methoden voor de isolatie van cholangiocyten van intrahepatische galwegen zijn goed ingeburgerd 1-4. Isolatie van extrahepatische ductale cellen, vooral van de pasgeborene, nog niet beschreven, hoewel dit van groot nut zou zijn in het begrijpen van de verschillen tussen verschillende populaties cholangiocyte en bestuderen ziekten zoals biliaire atresie die lijken de extrahepatische kanalen richten. Hier beschreven is een geoptimaliseerde techniek om zowel neonatale en volwassen muis extrahepatische galwegen cellen te isoleren. Deze techniek levert een zuivere celpopulatie met minimale verontreiniging van mesenchymale cellen zoals fibroblasten.
Deze methodiekd is gebaseerd op de verwijdering van de extrahepatische leidingen en galblaas, gevolgd door zorgvuldige dissectie en schrapen om vet en fibroblast lagen te verwijderen. Structuren zijn ingebed in dikke lagen collageen en gekweekt gedurende ongeveer 3 weken tot uitgroei van cholangiocyten in monolagen, die vervolgens kunnen worden getrypsiniseerd en opnieuw uitgeplaat voor experimenteel gebruik mogelijk.
Introduction
De oorsprong en de ontwikkeling van intra-en extrahepatische cholangiocyten aanzienlijk verschillen. De lever ontwikkelt uit een divertikel van de ventrale foregut endoderm 5. De caudale regio van de divertikel vormt de extrahepatische galwegen, terwijl de craniale regio genereert de intrahepatische galwegen 5. Intrahepatic kanaal cholangiocyten zijn afgeleid van stamcellen rond de ductale plaat in de peri portal regio 6. Deze cellen hebben het vermogen om te differentiëren in ofwel hepatocyten of cholangiocyten 6. Dit heeft belangrijke klinische implicaties aangezien cholangiopathies specifiek kan richten op een categorie cholangiocyten. Bijvoorbeeld, galgangatresie aanvankelijk van invloed op de extrahepatische leidingen van de pasgeborene, terwijl Alagille syndroom treft intrahepatic kanalen.
Zijn er meerdere beschrijvingen van de isolatie van intrahepatische cholangiocyten en galwegen eenheden van muizen en ratten. Investigators hebben enkele cellen geïsoleerd door kanaal isolatie en vervolgens uitgroei, of door de lever spijsvertering en antilichaam pull down van cholangiocyten expressie van specifieke celoppervlaktemerkers 1-4. Functionele en gepolariseerde galwegen units zijn geïsoleerd door de lever spijsvertering en grootte filtratie 7. Galgang eenheden kunnen reageren op stimuli secretoire en demonstreren vloeistofsecretie 7, terwijl geïsoleerd cholangiocyten is aangetoond ductulaire structuren in vitro 1,2. Beperkingen van deze methoden omvatten de behoefte aan gespecialiseerde technische expertise en speciale apparatuur voor leverperfusie met spijsverteringsenzymen. Bovendien is er een risico van besmetting met mesenchymale cellen 3.
Werkwijze voor extrahepatische galwegen cholangiocyten isoleren, in het bijzonder van neonatale extrahepatische galwegen, is niet eerder beschreven. Dit document schetst een vereenvoudigde methode om neonatale een isolerens en de meerderjarige extrahepatische galwegen cellen op een hoog niveau van zuiverheid. Deze techniek zal de studie van de verschillen tussen intra-en extrahepatische cholangiocyten en onderzoek naar de mechanismen van ziekten zoals galgangatresie dat de extrahepatische kanalen betrekken vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreven is een techniek om zuivere cholangiocyten isoleren van de extrahepatische galwegen van muizen muizen van elke leeftijd, inclusief pasgeborenen. De techniek biedt het voordeel dat extrahepatische cholangiocyten afzonderlijk kunnen worden bestudeerd vanuit intrahepatische cholangiocyten en kan studies belangrijkste verschillen tussen deze populaties van cellen te identificeren vergemakkelijken. We hebben onlangs een studie gepubliceerd demonstreren afgenomen cilia in extrahepatic cholangiocyten geïsoleerd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar voor de Moleculaire Pathologie en Imaging Core van de UPenn NIDDK Center for Molecular Studies in Digestive en Leverziekten (P30 DK50306) voor hulp bij beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 DK-092111) en uit de Fred en Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (tot RGW) en door een beurs van de Childhood Liver Disease Research and Education Network (SK).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500ml, used in BEC media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml, used in BEC media |
| MEM with non-essential amino acids | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml, used in BEC media |
| Insulin-transferrin-selenium | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml, used in BEC media |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5ml, used in BEC media |
| Chemically-defined lipid concentrate | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5ml, used in BEC media |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Gentamicin | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13ml, used in BEC media |
| MEM vitamin solution | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5ml, used in BEC media |
| Soybean trypsin inhibitor | Biowhittaker | 17-605E | 5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CL | 5ml, used in BEC media |
| Bovine pituitary extract | Gemini | 500-102 | 1.1ml, used in BEC media |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol |
| 3 3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol |
| Epidermal growth factor | millipore | 01-101 | 0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation |
| Rat-tail collagen | BD Biosciences | 354236 | variable depending on concentration of collagen |
| PBS 10X | USB Corporation | 75889 | use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| dH2O | N/A | N/A | sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| NaOH 10N | Fischer Scientific | ss255-1 | Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration |
| collagenase type XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | dilute in DMEM and sterile filter before use |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| trypsin-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml, incubate max 10 minutes |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | Other models acceptable |
| Light source (fiberoptic illuminator) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Other models acceptable |
| 12.5 cm straight iris scissors | Kent Scientific | Other models acceptable | |
| 6" non-serrated curved forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable | |
| 4" serrated stainless forceps with fine tips | Electron Microscopy Sciences | Other models acceptable |
Referências
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
