Isolering av Neonatal Ekstrahepatisk Cholangiocytes

Summary

En teknikk for å isolere cholangiocytes fra de ekstrahepatiske gallegangene av neonatal mus er beskrevet. Kanalene er omhyggelig dissekert, og cellene blir isolert ved utvekst i tykke kollagen geler. Denne metoden gir et nyttig verktøy for å studere ekstrahepatiske gallegang utvikling og patologi.

Abstract

De intra-og ekstrahepatiske galleganger i leveren er utviklingsmessig forskjellige, og kan være forskjellig påvirket av visse sykdommer. Men forskjellene mellom intra-og ekstrahepatiske cholangiocytes, og mellom nyfødte og voksne celler, er ikke godt forstått.

Metoder for isolering av cholangiocytes fra intrahepatiske galleganger er godt etablert ^1-4. Isolering av ekstrahepatiske duktale celler, spesielt fra den nyfødte, har ennå ikke blitt beskrevet, selv om dette ville være til stor nytte i å forstå forskjellene mellom forskjellige cholangiocyte populasjoner og i å studere sykdommer som galle atresi som synes å målrette de ekstrahepatiske kanaler. Beskrevet her er en optimalisert teknikk for å isolere både nyfødte og voksen mus ekstrahepatiske gallegang celler. Denne teknikken gir en ren cellepopulasjon med minimal forurensning fra mesenchymalceller som fibroblaster.

Dette method er basert på fjerning av ekstrahepatiske kanaler og galleblæren, etterfulgt av grundig disseksjon og skraping for å fjerne fett og fibroblast lag. Strukturer er forankret i tykke lag av kollagen og dyrket i omtrent 3 uker for å tillate utvekst av cholangiocytes i monolag, som deretter kan trypsinisert og på nytt belagt for eksperimentell bruk.

Introduction

Opprinnelsen og utviklingen av intra-og ekstrahepatiske cholangiocytes er markant annerledes. Leveren utvikler seg fra en divertikkel i ventral forutgående endoderm ^fem. Hale regionen av divertikkel danner ekstrahepatiske galletreet, mens skallen genererer intrahepatisk galletreet ^fem. Intrahepatiske kanal cholangiocytes er avledet fra stamceller rundt ductal plate i peri portal regioner ^seks. Disse celler har evnen til å differensiere til enten hepatocytter eller cholangiocytes ^6. Dette har betydelige kliniske implikasjoner gitt at cholangiopathies kan spesifikt mot en kategori av cholangiocytes. For eksempel, biliær atresi utgangspunktet påvirker ekstrahepatiske kanaler av den nyfødte, mens Alagille syndrom påvirker intrahepatiske kanaler.

Det finnes flere beskrivelser av isolering av intrahepatiske cholangiocytes og gallegang enheter fra mus og rotter. Isøkere har isolert enkeltceller ved kanal isolering og påfølgende utvekst, eller ved lever fordøyelse og antistoff trekk ned for cholangiocytes uttrykke markører spesifikke celleoverflate ^1-4. Funksjonelle og polarisert gallegang enheter har blitt isolert av leveren fordøyelse og størrelse filtrering ^7. Gallegang-enheter er i stand til å reagere på sekretorisk stimuli og demonstrere fluidsekresjon ^7, mens isolerte cholangiocytes har vist seg å utvikle ductular strukturer in vitro ^1,2. Begrensninger av disse metodene inkluderer behovet for spesialisert teknisk kompetanse og spesialutstyr for leverperfusjon med fordøyelsesenzymer. I tillegg er det en fare for forurensning med mesenchymale celler ^3.

En fremgangsmåte for å isolere ekstrahepatiske gallekanal cholangiocytes, spesielt fra neonatale ekstrahepatiske galleganger, ikke tidligere er blitt beskrevet. Dette notatet skisserer en forenklet metode for å isolere neonatal ens vel som voksne ekstrahepatiske gallekanalceller ved høye nivåer av renhet. Denne teknikken vil gjøre det lettere å studere forskjeller mellom intra-og ekstrahepatiske cholangiocytes og forskning på mekanismer for sykdommer som galle atresi som involverer de ekstrahepatiske kanaler.

Protocol

Hele fremgangsmåten blir utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Alle dyr arbeid skal utføres under humane forhold i henhold til en protokoll som er godkjent av den lokale Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). En. Utarbeidelse av utstyr og løsninger Sett opp muse kirurgisk tabellen i umiddelbar nærhet til vevskultur-hetten og inkubator (figur 1A). Merk: Nødvendig utstyr inkluderer en dissekere mikroskop, en lyskilde, 12,5 cm lange…

Representative Results

Bruken av denne protokollen resultater i isoleringen av en befolkning på neonatale mus ekstrahepatiske cholangiocytes med utmerket renhet, som demonstrert av K19 immunfluorescens farging (figurene 2A og 2B); vi oppnå lignende resultater isolere celler fra voksne mus. Vi har observert at det tar tre uker for celler fra nylig isolerte gallegangene for å danne monolayers på tykke kollagen gels. De cholangiocytes vokse på en lineær måte over hele den tykke kollagen og danner ark av celler fra de isol…

Discussion

Beskrevet her er en teknikk for å isolere rene cholangiocytes fra de ekstrahepatiske gallegangene av mus til mus i alle aldre, inkludert nyfødte. Teknikken har den fordelen at ekstrahepatiske cholangiocytes kan studeres separat fra intrahepatic cholangiocytes, og kan legge til rette for studier for å identifisere viktige forskjeller mellom disse populasjonene av cellene. Vi har nylig publisert en studie som viser redusert flimmerhårene i ekstrahepatiske cholangiocytes isolert ved denne metoden, og smittet med rhesus…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM/F12 (1:1)	Gibco/ Life technologies	11320-033	500ml, used in BEC media
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	25 ml, used in BEC media
MEM with non-essential amino acids	Gibco/ Life technologies	11140-019	5 ml, used in BEC media
Insulin-transferrin-selenium	Gibco/ Life technologies	51300-044	5 ml, used in BEC media
Na Pyruvate	Cellgro	25-000-CL	5ml, used in BEC media
Chemically-defined lipid concentrate	Gibco/ Life technologies	11905-031	5ml, used in BEC media
Penicillin-Streptomycin	Cellgro	30-002-CI	5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation
Gentamicin	Gibco/ Life technologies	15750-060	0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation
Ethanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ml	0.13ml, used in BEC media
MEM vitamin solution	Gibco/ Life technologies	11120-052	5ml, used in BEC media
Soybean trypsin inhibitor	Biowhittaker	17-605E	5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration
L-glutamine	Cellgro	25-005-CL	5ml, used in BEC media
Bovine pituitary extract	Gemini	500-102	1.1ml, used in BEC media
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol
3 3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma Aldrich	T6397	0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol
Epidermal growth factor	millipore	01-101	0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO
Fungizone	Gibco/ Life technologies	15290-018	1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation
Rat-tail collagen	BD Biosciences	354236	variable depending on concentration of collagen
PBS 10X	USB Corporation	75889	use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration
dH2O	N/A	N/A	sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration
NaOH 10N	Fischer Scientific	ss255-1	Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration
collagenase type XI from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657	dilute in DMEM and sterile filter before use
trypsin-EDTA (1x) 0.25%	Gibco/ Life technologies	25200-056	3 ml, incubate max 10 minutes
trypsin-EDTA (10x) 0.5%	Gibco/ Life technologies	15400-054	3 ml, incubate max 10 minutes
Dissecting microscope	Nikon	SMZ645	Other models acceptable
Light source (fiberoptic illuminator)	Schott-Fostec	Ace EKE LR 92240	Other models acceptable
12.5 cm straight iris scissors	Kent Scientific		Other models acceptable
6" non-serrated curved forceps with fine tips	Electron Microscopy Sciences		Other models acceptable
4" serrated stainless forceps with fine tips	Electron Microscopy Sciences		Other models acceptable