Vésicules extracellulaires jouent des rôles importants dans les processus physiologiques et pathologiques, y compris la coagulation, la réponse immunitaire, ou le cancer et comme agents thérapeutiques potentiels dans l'administration de médicaments ou de la médecine régénératrice. Ce protocole présente des méthodes pour la quantification et la caractérisation granulométrique des vésicules extracellulaires isolés et non-isolés dans divers liquides à l'aide accordable détection d'impulsion résistive.
Vésicules extracellulaires (VE), y compris les «microvésicules» et «exosomes», sont très abondants dans les fluides corporels. Ces dernières années ont vu une augmentation considérable de l'intérêt pour les véhicules électriques. On a montré que les véhicules électriques à jouer des rôles importants dans divers processus physiologiques et pathologiques, y compris la coagulation, la réponse immunitaire et du cancer. En outre, les véhicules électriques ont un potentiel en tant qu'agents thérapeutiques, par exemple comme véhicules d'administration de médicaments ou en tant que médecine régénératrice. En raison de leur petite taille (50 à 1000 nm) quantification précise et la taille profilage des véhicules électriques représente un défi technique.
Ce protocole décrit comment accordable impulsion résistive de détection (PST) de la technologie, en utilisant le système qNano, peut être utilisé pour déterminer la concentration et la taille des véhicules électriques. Le procédé, qui repose sur la détection des véhicules électriques lors de leur transfert à travers un pore de taille nanométrique, est relativement rapide, suffit l'utilisation de petits volumes d'échantillon et ne nécessite pas le purfication et de la concentration de véhicules électriques. Échantillons Suivant le protocole de fonctionnement normal une approche alternative est décrit en utilisant dopés avec des billes de polystyrène de taille et de concentration connue. Cette technique en temps réel d'étalonnage peut être utilisée pour surmonter les difficultés techniques rencontrées lors de la mesure VE directement dans les fluides biologiques.
Les vésicules d'origine cellulaire sont très abondants dans les fluides corporels 1. Ces vésicules dites extracellulaires (VE) (50 – 1 000 nm de taille) sont formés soit par fusion des corps multi-vésiculaires avec la membrane cellulaire ou vers l'extérieur par bourgeonnement direct de la membrane cellulaire. Au cours des dernières années, l'intérêt scientifique dans les véhicules électriques a considérablement augmenté, ce qui entraîne une pléthore de publications EV-concentré, dans lequel les nouvelles fonctions et les caractéristiques des véhicules électriques sont décrits 1. VE sont maintenant soupçonnés d'être impliqués dans un large éventail de processus physiologiques et pathologiques tels que la transduction du signal, la régulation immunitaire, et la coagulation du sang 1-4. Dans le cancer, les véhicules électriques semblent jouer un rôle dans la formation de niches prémétastatique 5,6, le transfert de pro-cancéreuse contenu 7,8 et la stimulation de l'angiogenèse 8. En outre, les véhicules électriques sont explorées comme agents d'exécution d'agents thérapeutiques 9.
Malgré ces dedéveloppements, la quantification fiable des véhicules électriques reste difficile. Traditionnellement, les méthodes de quantification indirects sont utilisés, qui repose sur la quantification de la teneur en protéines totales ou des protéines spécifiques. Bien que largement utilisé, ces techniques ne tiennent pas compte des différences de protéines par-EV, et ne discriminent pas entre la contamination des agrégats de protéines et de protéines dans les véhicules électriques. En outre, ces techniques nécessitent l'isolement des véhicules électriques, qui dans bien des cas rend la comparaison des concentrations de EV dans des échantillons biologiques impossible.
Par conséquent, des efforts sont entrepris pour développer de nouvelles méthodes qui permettent de mesurer EV plus précise et directe 10. Ce rapport décrit l'utilisation d'accordable détection d'impulsion résistive (de permis de séjour temporaire) pour la quantification fiable et la taille profilage des véhicules électriques.
Actuellement, la qNano instrument (Figure 1a) est la seule plate-forme disponible dans le commerce pour les points sensibles. Dans les points sensibles, une membrane élastique non-conducteur ponctué wie un pore nanométrique est séparant deux cellules du liquide. L'une des cellules du liquide est rempli avec l'échantillon d'intérêt, tandis que l'autre cellule est remplie d'électrolyte exempte de particules. En appliquant une tension, un flux / courant électrique ionique est établi, qui est modifié lors du transfert des particules à travers les pores (Figure 1b). L'ampleur de ce blocage de courant ('d'impulsion résistive') est proportionnelle au volume de la particule 11 (figure 1c). La durée de blocage peut être utilisé pour évaluer le potentiel zêta de particules, qui s'appuie sur les caractéristiques des particules telles que la charge ou de la forme 12. Taille des particules de profilage inconnu peut être effectuée en comparant les impulsions de résistifs provoqués par les particules inconnues avec les impulsions de résistifs provoqués par des particules d'étalonnage d'un diamètre connu. En plus de la grandeur d'un événement de blocage, le taux de celles-ci qui se produisent est mesurée. Ce taux de comptage relies sur la concentration des particules. Comme la concentration et la vitesse de blocages sont linéairement proportionnel 13, à l'aide d'un seul échantillon d'étalonnage avec une concentration connue de particules et la taille des particules permet la mesure de la concentration 14 et la distribution de taille 11 d'un échantillon inconnu.
Le mouvement des particules à travers le nanopore est déterminée par les forces électro kinetic- (électrophorèse et électro-osmotique) et fluidiques 15. En utilisant le module de pression variable (VPM) une différence de pression de fluide entre les cellules peut être induite en tant que force supplémentaire. En appliquant une pression positive augmente le taux de particules de flux, ce qui peut être bénéfique lorsque la concentration en particules est faible. En outre, la pression peut être appliquée pour réduire l'effet des forces électro-cinétique. Ceci est particulièrement important lors de l'utilisation des nanopores par rapport à un diamètre de pores de petite taille (NP100, NP150 et NP200 éventuellement) le plus souvent utilisé pour la détection de véhicules électriques.Pour ces nanopores, même en appliquant une forte pression, les forces électro-cinétique peuvent, en fonction de la charge de surface des particules, rester non négligeable 16. En mesurant le taux de particules à plusieurs pressions, un électro-cinétique corrigée, et par conséquent plus précis, la concentration EV peut être calculé.
Ici, les protocoles détaillés sont fournis pour déterminer la distribution de la taille et de la concentration de véhicules électriques. Suivant le protocole de fonctionnement normal, une autre approche est décrite où les échantillons sont dopés avec des billes de polystyrène de la taille et de la concentration 17 connue. Cette technique de calibration en temps réel peut être utilisée pour surmonter certaines des difficultés techniques rencontrées lors de la mesure VE directement dans les fluides biologiques, tels que l'urine, le plasma et le surnageant de culture cellulaire, ou lorsque la stabilité du nanopore pendant une longue période de temps de mesure ne peut pas être assurée.
Les protocoles décrits dans cette offre manuscrits méthodologies de quantification et de caractérisation granulométrique des véhicules électriques à l'aide de points sensibles. Les principaux avantages de la plate-forme les points sensibles sont la petite taille de l'échantillon, la durée de mesure relative courte et l'absence de manipulation de l'échantillon nécessaire.
Pré-requis pour la mesure de précision les points sensibles est de maintenir des conditions identiques entre étalonnage et mesures d'échantillons. Cela comprend l'utilisation de tampons identiques ainsi que les paramètres d'instruments identiques, tels que la taille de nanopores, la tension et la pression appliquée. Le manque de VPM originale d'un mécanisme de réglage précis de la pression appliquée, ce qui provoque de légères différences de pression appliquée entre les échantillons. De plus, l'évaporation du fluide d'amorçage dans la VPM peut induire des différences mineures de la pression lors de la mesure à différents points dans le temps et le VPM doit donc souvent être ré-amorçage. Ces limitations ont potentiellement été résolu par l'introduction de la VPM2, quia une mise à l'échelle en fonction de clic et est basée sur la pression de l'air.
Le protocole alternatif décrit dans ce manuscrit est particulièrement adapté pour la mesure des véhicules électriques dans des échantillons biologiques purifiés non 17. Nous pensons que les composants tampons, tels que des sucres, des lipides, des protéines et d'autres débris plus grande, dans certains cas, peut influencer les conditions de mesure trop pour le protocole standard pour être applicable. Ajout de billes de calibration de l'échantillon plutôt que de comparer deux mesures distinctes introduit «vrai étalonnage de l'heure». Cette méthode est particulièrement appropriée lorsque l'on compare les échantillons (par exemple du plasma sanguin de donneurs différents) qui ont différents et / ou le contenu d'arrière-plan inconnu fluidiques. Bien que des différences existent entre les véhicules électriques et les particules de polystyrène (densité de particules par exemple, et de charge de surface), les modèles théoriques et les données expérimentales souligner la facilité d'utilisation de billes de polystyrène pour la quantification et la taille profilage des véhicules électriques,sous la condition que la pression importante appliquée à 15,19. Afin de minimiser l'influence des forces électrocinétiques, l'utilisation de la relativement plus NP150 / NP200 nanopores et pression positive significative est conseillé.
Véhicules électriques et billes de calibration se distinguent par la taille. Par conséquent, le nanopore doit être ouvert par l'application d'étirage, à un diamètre de détection où les véhicules électriques et les grandes particules d'étalonnage est observée. Depuis l'ouverture du pore diminue la sensibilité à l'égard des particules plus petites, ne EVS supérieure à une certaine taille sont enregistrées (souvent les véhicules électriques> 120 nm en utilisant un étalonnage perle 335 nm). La limite de détection pour les véhicules électriques peut être réduite à environ 90 nm, en utilisant 203 billes de calibration nm sur un nanopores NP150. Toutefois, cette configuration peut être viable lorsque de plus grandes voitures électriques induisent colmatage fréquent des nanopores. La présence de ces véhicules électriques obstruction peut forcer l'utilisation d'une configuration où une population de véhicules électriques, trop petit pour reach le seuil de détection, ne sera pas détecté.
La difficulté à faire fonctionner le système augmente en essayant de mesurer les particules plus petites que 100 nm. Dans de tels cas, la détection peut être améliorée en augmentant la concentration en sel de l'électrolyte. Une concentration d'ions accrue va induire une augmentation relative des grandeurs de blocus pour les petites particules (ratio plus grand signal-sur-bruit). La viabilité de cette technique pour les mesures de véhicules électriques doit être validé même si, comme l'augmentation des concentrations de sel peuvent influencer le volume des véhicules électriques.
En conclusion, la plate-forme de permis de séjour temporaire peut être utilisé pour la quantification directe et caractérisation granulométrique des véhicules électriques. Comme aucun isolement ou de manipulation EV (anticorps de marquage fluorescent ou de liaison) est nécessaire, la plate-forme est adapté à la quantification EV directe dans des fluides biologiques. Un protocole alternatif est fourni qui peut être bénéfique pour des échantillons où les composants du tampon induisent importante de pores clogginévénements g, ce qui rend l'utilisation fiable du protocole standard viable.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |