الحويصلات خارج الخلية تلعب دورا هاما في العمليات الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك تجلط الدم، الاستجابات المناعية، وسرطان أو وكلاء العلاجية المحتملة كما في تسليم المخدرات أو الطب التجديدي. يعرض هذا البروتوكول أساليب لتقدير حجم وخصائص الحويصلات خارج الخلية المعزولة وغير المعزولة في السوائل المختلفة باستخدام الاستشعار عن الانضباطي مقاوم النبض.
الحويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية)، بما في ذلك "microvesicles 'و' exosomes، وفيرة للغاية في سوائل الجسم. وقد شهدت السنوات الأخيرة زيادة هائلة في الاهتمام المركبات الكهربائية. وقد ثبت المركبات الكهربائية للعب أدوار مهمة في مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية، بما في ذلك تجلط الدم، الاستجابات المناعية، والسرطان. بالإضافة إلى ذلك، المركبات الكهربائية المحتملة لها كعوامل علاجية، على سبيل المثال بوصفها وسائل إيصال المخدرات أو الطب التجديدي. بسبب صغر حجم (50 إلى 1،000 نانومتر) الكمي الدقيق وحجم التنميط من المركبات الكهربائية يمثل تحديا تقنيا.
يصف هذا البروتوكول كيف الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار (الحزب الراديكالي عبر الوطني) والتكنولوجيا، وذلك باستخدام نظام qNano، يمكن أن تستخدم لتحديد تركيز وحجم المركبات الكهربائية. الطريقة التي تعتمد على الكشف عن المركبات الكهربائية على نقلهم من خلال المسام نانو الحجم، سريع نسبيا، يكفي استخدام أحجام عينة صغيرة ولا تتطلب بورification وتركيز المركبات الكهربائية. ارتفعت عينات المقبلة لبروتوكول عملية منتظمة يوصف نهج بديل يستخدم مع الخرز البوليسترين من حجم معروف والتركيز. هذا في الوقت الحقيقي تقنية المعايرة يمكن استخدامها للتغلب على العقبات الفنية اجه عند قياس المركبات الكهربائية مباشرة في السوائل البيولوجية.
الحويصلات من أصل الخلوي وفيرة للغاية في سوائل الجسم 1. تتشكل – (1،000 نانومتر في حجم 50) إما الانصهار هيئات متعددة حويصلي مع الغشاء الخلوي أو عن طريق التبرعم الخارجي المباشر للغشاء الخلوي هذه يسمى الحويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية). في السنوات الأخيرة، والفائدة العلمية في المركبات الكهربائية ازداد الى حد كبير، مما أدى إلى عدد كبير من المطبوعات التي تركز على EV، التي تم وصفها وظائف وخصائص المركبات الكهربائية الجديدة 1. ويعتقد أن المركبات الكهربائية الآن أن تشارك في مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية والمرضية مثل نقل الإشارة، وتنظيم المناعة، وتخثر الدم 1-4. في السرطان، يبدو أن السيارات الكهربائية للعب دور في تشكيل منافذ premetastatic 5،6، ونقل المحتوى الموالية لل7،8 السرطاني وتنشيط الأوعية الدموية 8. بالإضافة إلى ذلك، يتم استكشاف المركبات الكهربائية كوكلاء تسليم العوامل العلاجية 9.
على الرغم من هذه ديvelopments، الكمي موثوق بها من المركبات الكهربائية لا يزال تحديا. تقليديا، يتم استخدام أساليب القياس الكمي غير المباشرة، التي تعتمد على القياس الكمي لمحتوى البروتين الكلي أو بروتينات معينة. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع، وهذه التقنيات لا تشكل البروتين لكل EV الاختلافات، ولا تميز بين تلويث المجاميع البروتين والبروتينات في المركبات الكهربائية. وعلاوة على ذلك، هذه التقنيات تتطلب عزل المركبات الكهربائية، مما يجعل المقارنة بين تركيزات EV في العينات البيولوجية مستحيلا في كثير من الحالات.
ولذلك، تبذل جهود لتطوير أساليب جديدة تسمح لقياس EV أكثر دقة ومباشرة 10. ويصف هذا التقرير استخدام الانضباطي الاستشعار مقاوم النبض (الحزب الراديكالي عبر الوطني) لتقدير موثوق بها وحجم التنميط من المركبات الكهربائية.
حاليا، وqNano أداة (الشكل 1A) هو منصة فقط متاحة تجاريا للالحزب الراديكالي عبر الوطني. في الحزب الراديكالي عبر الوطني، تتخللها غشاء مرن غير موصل وايعشر المسام نانو الحجم وفصل خليتين السوائل. يتم تعبئة إحدى الخلايا السوائل مع عينة من الفائدة، في حين يتم تعبئة الخلايا الأخرى مع خالية من الجسيمات بالكهرباء. عن طريق تطبيق الجهد، يتم إنشاء ل/ تدفق التيار الكهربائي الأيونية، والتي يتم تبديل على نقل الجزيئات من خلال المسام (الشكل 1B). حجم هذا الحصار الحالي ('نبض مقاوم') يتناسب مع حجم الجسيمات 11 (الشكل 1C). مدة الحصار يمكن استخدامها لتقييم إمكانات زيتا من الجزيئات، التي تعتمد على خصائص الجسيمات مثل تهمة أو شكل 12. حجم الجسيمات التنميط غير معروفة يمكن أن يؤديها من خلال مقارنة النبضات مقاوم تسببها الجزيئات غير معروفة مع نبضات مقاوم الناجمة عن الجسيمات التي يبلغ قطرها المعايرة المعروفة. إلى جانب ضخامة الحدث الحصار، ويقاس معدل هذه التي تحدث. هذا RELI معدل عددوفاق على تركيز الجسيمات. حيث أن تركيز ومعدل الحصار هم خطيا النسبي 13، باستخدام عينة معايرة واحدة مع تركيز جزيئات معروفة وحجم الجسيمات يسمح لقياس تركيز 14 و 11 من توزيع حجم عينة مجهولة.
يتم تحديد حركة الجزيئات من خلال ثقب النانو من قبل قوات الكهربائية kinetic- (الكهربي والكهربائية التناضحي) والموائعية 15. باستخدام وحدة ضغط متغير (VPM) فرق الضغط بين الخلايا السوائل يمكن أن يتسبب كقوة إضافية. تطبيق الضغط الايجابي يزيد من معدل تدفق الجسيمات، والتي قد تكون ذات فائدة عندما يكون تركيز الجسيمات منخفضة. أيضا، يمكن تطبيق ضغط للحد من تأثير القوى الكهربائية الحركية. هذا مهم خصوصا عند استخدام نانوية بقطر النسبي مسام صغيرة (NP100، NP150 وربما NP200) وغالبا ما تستخدم للكشف عن المركبات الكهربائية.لهذه نانوية حتى عند تطبيق ضغط كبير وقوى الكهربائية الحركية يمكن، اعتمادا على الجسيمات تهمة السطح، تبقى nonnegligible 16. عن طريق قياس معدل الجسيمات في ضغوط متعددة، وهو كهربية تصحيح حركيا، وبالتالي أكثر دقة، يمكن حساب تركيز EV.
هنا، يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتحديد حجم التوزيع وتركيز المركبات الكهربائية. بجانب بروتوكول تشغيل منتظم، وصفت نهج بديل حيث ارتفعت العينات مع الخرز البوليسترين من حجم معروف وتركيز 17. هذه التقنية المعايرة في الوقت الحقيقي يمكن استخدامها للتغلب على بعض التحديات التقنية واجهتها عند قياس المركبات الكهربائية مباشرة في السوائل البيولوجية، مثل البول، والبلازما وزراعة الخلايا طاف، أو عند استقرار ثقب النانو على مدى فترة طويلة من الزمن قياس لا يمكن أن يكون ضمان.
البروتوكولات الموضحة في هذه المنهجيات عرض مخطوطة لتقدير حجم وخصائص المركبات الكهربائية باستخدام الحزب الراديكالي عبر الوطني. أهم مزايا منصة الحزب الراديكالي عبر الوطني هي صغر حجم العينة، النسبية قياس مدة قصيرة وغياب المطلوبة التلاعب العينة.
شرط أساسي لقياس دقيق الحزب الراديكالي عبر الوطني هو الحفاظ على ظروف مماثلة بين معايرة والعينة. هذا يشمل استخدام مخازن مماثلة وكذلك إعدادات أداة مماثلة، مثل حجم ثقب النانو، والجهد والضغوط التي مورست. وVPM الأصلي يفتقر الى آلية لتحديد الدقيق للضغط المطبق، مما يسبب اختلافات طفيفة في الضغوط التي مورست بين العينات. أيضا، تبخر السوائل في فتيلة VPM يمكن أن تحدث اختلافات طفيفة عند قياس الضغط عند نقاط زمنية مختلفة وVPM يجب بالتالي غالبا ما يعاد معبي. ويحتمل أن تكون هذه القيود تم حلها بواسطة إدخال VPM2، التيلديه القياس القائم على نقرة ويقوم ضغط الهواء.
بروتوكول بديل وصفها في هذه المخطوطة هي مناسبة خاصة لقياس المركبات الكهربائية في العينات البيولوجية غير المنقى 17. ونحن نعتقد أن مكونات العازلة، مثل السكريات والدهون والبروتينات وغيرها من الحطام أكبر، ويمكن في بعض الحالات تؤثر على الكثير من شروط القياس لبروتوكول قياسي لتكون قابلة للتطبيق. إضافة الخرز المعايرة للعينة بدلا من المقارنة بين اثنين من القياسات منفصلة يقدم "المعايرة في الوقت الحقيقي. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة عند مقارنة عينات (مثل بلازما الدم من مختلف الجهات المانحة) التي لديها مختلفة و / أو غير معروفة محتويات خلفية الموائعية. على الرغم من وجود اختلافات بين المركبات الكهربائية وجزيئات البوليستيرين (مثل كثافة الجسيمات وتهمة السطحية)، والنماذج النظرية وكذلك البيانات التجريبية تؤكد على قابليتها للاستخدام من الخرز البوليسترين لتقدير حجم والتنميط من المركبات الكهربائية،تحت شرط أن يتم تطبيق ضغط كبير 15،19. للحد من تأثير القوى حركي كهربي، وينصح استخدام من أكبر نسبيا NP150 / NP200 ثقب النانو وضغط إيجابي كبير.
وتتميز السيارات الكهربائية والخرز المعايرة من حيث الحجم. وبالتالي، فإن ثقب النانو لابد من فتح طريق تطبيق تمتد، إلى قطر حيث لوحظ الكشف عن كل من المركبات الكهربائية ومعايرة جزيئات أكبر. منذ افتتاح المسام وتقلل من حساسية تجاه جسيمات أصغر، المركبات الكهربائية فقط أكبر من حجم معين يتم تسجيلها (غالبا المركبات الكهربائية> 120 نانومتر عند استخدام 335 نانومتر المعايرة حبة). يمكن انخفض الحد الأدنى لكشف المركبات الكهربائية إلى حوالي 90 نانومتر، وذلك باستخدام 203 نانومتر الخرز المعايرة على ثقب النانو NP150. ومع ذلك، قد يكون هذا الإعداد غير مجدية عندما المركبات الكهربائية الكبيرة تحفز انسداد المتكرر للثقب النانو. وجود هذه المركبات الكهربائية عرقلة قد يجبر الاستفادة من الإعداد حيث يبلغ عدد سكانها المركبات الكهربائية، صغير جدا لالجرميةCH يقع عتبة الكشف، لن يتم الكشف عنها.
صعوبة لتشغيل يزيد النظام عند محاولة قياس جسيمات أصغر من 100 نانومتر في الحجم. في مثل هذه الحالات، يمكن تحسين الكشف عن طريق زيادة تركيز ملح بالكهرباء. ومن شأن زيادة تركيز أيون تحفز زيادة نسبيا مقادير الحصار عن جزيئات صغيرة (أكبر نسبة الإشارة إلى الضوضاء). جدوى هذه التقنية لقياس المركبات الكهربائية لابد من التحقق من صحتها على الرغم، كما زاد تركيز الملح قد يؤثر على حجم المركبات الكهربائية.
في الختام، ومنصة الحزب الراديكالي عبر الوطني يمكن استخدامها لتقدير حجم المباشر وتوصيف المركبات الكهربائية. منذ لا يلزم العزلة أو التلاعب EV (الضد ملزمة أو وضع العلامات الفلورية)، ومنصة مناسبة لتقدير EV المباشر في السوائل البيولوجية. يتم توفير بروتوكول بديل يمكن أن تكون مفيدة للعينات حيث مكونات عازلة تحفز cloggin المسام الكبيرةز الأحداث، مما يجعل استخدام موثوق لبروتوكول قياسي غير مجدية.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |