Extrazellulären Vesikeln spielen eine wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs oder als potentielle therapeutische Mittel bei der Arzneimittelabgabe oder der regenerativen Medizin. Dieses Protokoll stellt Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe isoliert und nicht-isoliert extrazellulären Vesikeln in verschiedenen Flüssigkeiten mit abstimmbaren Widerstandspulsmessung.
Extrazellulären Vesikeln (EVS), einschließlich "Mikrovesikeln" und "Exosomen", sind sehr reichlich in Körperflüssigkeiten. Die letzten Jahre haben einen enormen Anstieg der Zinsen in EVs erlebt. EVs sind gezeigt worden, um eine wichtige Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs. Darüber hinaus haben EVs Potential als therapeutische Mittel, beispielsweise als Arzneimittelabgabevehikel oder der regenerativen Medizin. Aufgrund ihrer geringen Größe (50 bis 1.000 nm) genaue Quantifizierung und Größe Profilierung der Elektrofahrzeuge ist technisch anspruchsvoll.
Dieses Protokoll beschreibt abstimmbaren Widerstandserfassungsimpuls (TRP)-Technologie unter Verwendung des qNano System kann verwendet werden, um die Konzentration und Größe EVs bestimmen. Das Verfahren, das durch eine Nanoporengröße auf der Detektion von EVs auf ihre Übertragung beruht, relativ schnell ist, reicht die Verwendung von kleinen Probenmengen und nicht PUR erfordernkation und Konzentration von Elektrofahrzeugen. Neben dem regulären Betrieb Protokoll ein alternativer Ansatz beschrieben, unter Verwendung von Proben gespickt mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Größe und Konzentration. Diese Echtzeit-Kalibrierungstechnik kann verwendet werden, um technische Hürden überwunden werden, die auftreten, wenn die Messung direkt EVs in biologischen Flüssigkeiten.
Vesikel aus zellulären Ursprungs sind sehr reichlich in Körperflüssigkeiten 1. Diese sogenannten extrazellulären Vesikeln (EFD) (50 – 1.000 nm in der Größe) werden entweder durch Fusion von Mehr vesikulären Körper mit der Zellmembran oder durch eine direkte außen knospe der Zellmembran gebildet. In den letzten Jahren hat das wissenschaftliche Interesse an Elektrofahrzeugen stark erhöht, was zu einer Fülle von EV orientierte Publikationen, in denen neue Funktionen und Eigenschaften von Elektrofahrzeugen werden beschrieben 1. EVs sind nun angenommen, dass in einer breiten Palette von physiologischen und pathologischen Prozessen wie Signaltransduktion, Immunregulation und Blutgerinnung 1-4 einbezogen werden. Bei Krebs, Elektrofahrzeuge scheinen eine Rolle bei der Bildung von 5,6 premetastatic Nischen, die Übertragung von Pro-Krebs Inhalt 7,8 und Anregung der Angiogenese 8 zu spielen. Daneben werden EVs als Zusteller von Therapeutika 9 erforscht.
Trotz dieser deEntwicklungen bleibt zuverlässige Quantifizierung von Elektrofahrzeugen eine Herausforderung. Traditionell sind indirekte Verfahren zur Quantifizierung verwendet, die auf der Bestimmung des Gesamtproteingehalts oder spezifischen Proteinen beruhen. Obwohl allgemein verwendet, müssen diese Techniken nicht für die Protein-per-EV Unterschiede ausmachen, und nicht zwischen gefährdend Proteinaggregate und Proteinen in EVs unterscheiden. Darüber hinaus erfordern diese Techniken Isolierung von Elektrofahrzeugen, die in vielen Fällen einen Vergleich der EV-Konzentrationen in biologischen Proben, nicht möglich ist.
Daher werden Anstrengungen unternommen, um neue Methoden, die für mehr präzise und direkte Messung EV 10 erlauben zu entwickeln. Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von einstellbaren Pulswiderstandserkundung (TRP) für eine zuverlässige Quantifizierung und Größe Profilierung der Elektrofahrzeuge.
Derzeit ist die qNano Gerät an (Abbildung 1a) ist das einzige kommerziell verfügbare Plattform für trpS. In TRP, punktiert eine nicht-leitende elastische Membran witen einer Nano-Poren trennt zwei Fluidzellen. Einer der Fluidkammern ist mit der interessierenden Probe gefüllt, während die andere Zelle mit partikelfreien Elektrolyten gefüllt. Durch Anlegen einer Spannung wird ein Ionenstrom / elektrischem Strom geschaffen, das bei der Übertragung von Teilchen durch die Poren verändert wird (Abbildung 1b). Die Stärke dieses Stroms Blockade ("resistive pulse") ist proportional zu dem Volumen des Teilchens 11 (Figur 1c). Die Blockade Dauer kann verwendet werden, um das Zeta-Potential der Teilchen, die auf die Partikeleigenschaften wie Ladung oder die Form 12 verlässt bewerten. Größe Profilierung unbekannter Partikel kann durch Vergleich der Widerstandsimpulse, die durch den unbekannten Teilchen mit den Widerstandsimpulse, die durch Kalibrierung Teilchen mit einem bekannten Durchmesser verursacht geführt werden. Neben der Größe einer Blockade Fall wird die Rate von denen diese auftreten, gemessen. Diese Zählrate relies von der Partikelkonzentration. Da die Konzentration und die Geschwindigkeit der Blockaden linear proportional 13, unter Verwendung eines einzigen Kalibrierungsprobe mit Partikeln bekannter Konzentration und Teilchengrße ermöglicht die Messung der Konzentration 14 und Größenverteilung 11 einer unbekannten Probe.
Die Bewegung der Teilchen durch die Nanopore wird elektro kinetisch (elektrophoretische und elektroosmotische) und Fluidkräfte 15 bestimmt. Durch Verwendung der variablen Druckmodul (VPM) eine Druckdifferenz zwischen den Fluidzellen können als zusätzliche Kraft induziert werden. Aufbringen von Überdruck erhöht sich die Strömungsrate der Teilchen, die von Nutzen sein können, wenn die Partikelkonzentration niedrig ist. Auch kann Druck aufgebracht werden, um die Wirkung der elektrokinetischen Kräfte zu reduzieren. Dies ist besonders wichtig bei der Verwendung von Nanoporen mit relativ kleinen Porendurchmesser (NP100, NP150 und NP200 möglicherweise) so oft für den Nachweis von EVs verwendet.Für diese Nanoporen, auch bei der Anwendung erheblichen Druck, die elektrokinetische Kräfte, je nach Partikeloberflächenladung, bleiben nicht vernachlässigbare 16. Durch die Messung der Partikelrate bei Mehrfachbelastungen, ein elektro kinetisch korrigiert und damit genauer, kann EV-Konzentration berechnet werden.
Hier werden detaillierte Protokolle bereitgestellt, um die Größenverteilung und Konzentration von Elektrofahrzeugen zu ermitteln. Neben dem regulären Betrieb Protokoll wird ein alternativer Ansatz beschrieben, bei dem Proben mit Polystyrol-Kügelchen bekannter Größe und Konzentration 17 versetzt. Diese Echtzeit-Kalibrierungsverfahren kann verwendet werden, zu überwinden einige der technischen Probleme auftreten, wenn die Messung EVs direkt in biologischen Flüssigkeiten, wie Urin, Plasma und Zellkulturüberstand, oder wenn die Stabilität der Nanopore über einen langen Zeitraum der Messzeit kann nicht sichergestellt.
Die in diesem Angebot Manuskript Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe EVs mit trpS beschriebenen Protokollen. Die wichtigsten Vorteile der trpS Plattform sind die geringen Stichprobengröße relativ kurze Messdauer und das Fehlen der erforderlichen Probenmanipulation.
Voraussetzung für eine genaue Messung ist trpS gleichen Bedingungen zwischen Kalibrierung und Probenmessungen zu halten. Dies umfasst die Verwendung von identischen Puffern sowie identische Geräteeinstellungen, wie beispielsweise Nanoporengröße, Spannung und Druck aufgebracht. Die ursprüngliche VPM fehlt ein Mechanismus für die exakte Einstellung der aufgebrachte Druck, wodurch kleine Unterschiede in der angewandten Druck zwischen den Proben verursacht. Außerdem kann die Verdampfung der Flüssigkeit in der Grundierung VPM geringe Druckdifferenzen zu induzieren, wenn die Messung zu unterschiedlichen Zeitpunkten und das VPM daher oft neu grundiert werden. Diese Einschränkungen haben möglicherweise durch die Einführung des VPM2, gelöst worden, diehat einen Klick-basierte Skalierung und Luftdruck.
Die in diesem Manuskript beschrieben alternatives Protokoll ist besonders geeignet für die Messung von EVs in nicht gereinigten biologischen Proben 17. Wir glauben, daß Pufferkomponenten, wie beispielsweise Zucker, Lipide, Proteine und andere Grobschmutz kann in einigen Fällen die Messbedingungen zu viel für das Standardprotokoll beeinflussen anwendbar. Neben der Kalibrierung Perlen auf die Probe und nicht den Vergleich von zwei separaten Messungen führt "Echtzeit-Kalibrierung '. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere bei einem Vergleich Proben (zB Blutplasma von verschiedenen Spendern), die verschiedene und / oder unbekannten Fluidhintergrundgehalte haben. Obwohl die Unterschiede zwischen Elektrofahrzeugen und Polystyrol-Partikel (zB Partikeldichte und Oberflächenladung), theoretische Modelle als auch experimentelle Daten vorhanden sind unterstreichen die Benutzerfreundlichkeit von Polystyrol-Kügelchen für die Quantifizierung und Größe Profilierung von Elektrofahrzeugen,unter der Voraussetzung, dass erhebliche Druck ausgeübt wird, 15,19. Um den Einfluss von elektrokinetische Kräfte zu minimieren, ist die Nutzung der relativ größeren NP150 / NP200 Nanoporen und signifikant positiven Druck geraten.
EVs und Kalibrierung Perlen werden nach Größe unterschieden. Folglich hat der Nanopore durch Anlegen Strecke bis zu einem Durchmesser, bei dem Nachweis beider EVs und die größeren Partikel Kalibrierung beobachtet geöffnet werden. Seit der Eröffnung des Poren wird die Empfindlichkeit in Richtung kleinerer Partikel zu verringern, EVS nur größer als eine bestimmte Größe aufgezeichnet (oft EVs> 120 nm bei Verwendung eines 335 nm Kalibrationsbeadsets). Die Nachweisgrenze für Elektrofahrzeuge auf etwa 90 nm verringert werden kann, mit 203 nm Kalibrierung Perlen auf einer NP150 Nanoporen. Dies kann jedoch nicht lebensfähig sein, wenn Setup größeren EVs induzieren häufige Verstopfung der Nanoporen. Das Vorhandensein dieser Behinderung EVs kann die Verwendung einer Einrichtung zwingen, wenn eine Population von EVs, zu klein, um reach die Detektionsschwelle, werden nicht erkannt.
Die Schwierigkeit für den Betrieb des Systems erhöht sich, wenn versucht wird, die kleiner als 100 nm Größe zu messen. In solchen Fällen kann der Nachweis durch Erhöhung der Salzkonzentration des Elektrolyten verbessert werden. Eine erhöhte Ionenkonzentration relativ erhöht Blockade Grßen für kleine Teilchen (größeres Signal-zu-Rausch-Verhältnis) zu induzieren. Die Lebensfähigkeit dieser Technik für Messungen von Elektrofahrzeugen muss aber überprüft werden, da erhöhte Salzkonzentrationen kann die Lautstärke von Elektrofahrzeugen beeinflussen.
Abschließend kann trpS Plattform für den direkten Quantifizierung und Charakterisierung von Elektrofahrzeugen Größe verwendet werden. Da keine Isolation oder EV Manipulation (Antikörper-Bindungs oder Fluoreszenzmarkierung) erforderlich ist, ist die Plattform für die direkte Quantifizierung EV in biologischen Flüssigkeiten. Eine alternative Protokoll vorgesehen ist, die vorteilhaft für Proben werden kann, wo Pufferkomponenten induzieren signifikante Poren clogging Ereignisse, so dass zuverlässige Nutzung des Standard-Protokoll nicht lebensfähig.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |