कोशिकी पुटिकाओं जमावट, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और कैंसर या दवा वितरण या पुनर्योजी दवा के रूप में संभावित चिकित्सीय एजेंट सहित शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इस प्रोटोकॉल ट्यून करने योग्य प्रतिरोधक पल्स संवेदन का उपयोग कर विभिन्न तरल पदार्थ में अलग और गैर पृथक कोशिकी पुटिका की मात्रा का ठहराव और आकार लक्षण वर्णन के लिए तरीके प्रस्तुत करता है.
'Microvesicles' और 'exosomes' सहित कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस), शारीरिक तरल पदार्थ में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में हैं. हाल के वर्षों में ईवीएस में ब्याज में भारी वृद्धि देखी गई है. ईवीएस जमावट, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और कैंसर सहित विभिन्न शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, ईवीएस दवा वितरण वाहनों के रूप में उदाहरण के लिए या पुनर्योजी दवा के रूप में, चिकित्सीय एजेंट के रूप में संभावित है. क्योंकि उनके छोटे आकार (50 करने के लिए 1000 एनएम) की सटीक मात्रा का ठहराव और ईवीएस के आकार की रूपरेखा तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है.
इस प्रोटोकॉल qNano प्रणाली का उपयोग कर, कैसे ट्यून करने योग्य प्रतिरोधक पल्स संवेदन (टीआरपी) तकनीक का वर्णन, ईवीएस की एकाग्रता और आकार निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक नैनो आकार ताकना के माध्यम से अपने स्थानांतरण पर ईवीएस का पता लगाने पर निर्भर करता है, जो विधि,,, अपेक्षाकृत तेज है छोटा सा नमूना संस्करणों का उपयोग suffices और पुर की आवश्यकता नहीं हैification और ईवीएस की एकाग्रता. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग वर्णित है नियमित संचालन प्रोटोकॉल को अगले नमूने ज्ञात आकार और एकाग्रता की polystyrene मोती के साथ नुकीला. जैविक तरल पदार्थ में सीधे ईवीएस मापने जब अंशांकन तकनीक तकनीकी बाधाओं को पार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यह वास्तविक समय का सामना करना पड़ा.
सेलुलर मूल से vesicles शारीरिक तरल पदार्थ 1 में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में हैं. ये तथाकथित कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस) (50 – आकार में 1000 एनएम) सेलुलर झिल्ली के साथ बहु vesicular निकायों के दोनों संलयन द्वारा या सेलुलर झिल्ली के प्रत्यक्ष जावक नवोदित द्वारा गठित कर रहे हैं. हाल के वर्षों में, ईवीएस में वैज्ञानिक ब्याज काफी नए कार्य और ईवीएस की विशेषताओं 1 वर्णित हैं जिसमें EV केंद्रित प्रकाशनों की अधिकता, जिसके परिणामस्वरूप में वृद्धि हुई है. ईवीएस अब ऐसे संकेत पारगमन, प्रतिरक्षा विनियमन, और रक्त जमावट 1-4 के रूप में शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं की एक व्यापक सरणी में शामिल होना माना जाता है. कैंसर में, ईवीएस premetastatic आलों 5,6, angiogenesis 8 के समर्थक कैंसर सामग्री 7,8 के हस्तांतरण और उत्तेजना के गठन में एक भूमिका निभाने के लिए लग रहे हैं. इस के अलावा, ईवीएस चिकित्सीय एजेंट 9 के वितरण एजेंट के रूप में पता लगाया है.
इन डे के बावजूदvelopments, ईवीएस के विश्वसनीय मात्रा का ठहराव चुनौती बनी हुई है. परंपरागत रूप से, अप्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव तरीकों कुल प्रोटीन सामग्री या विशिष्ट प्रोटीन की मात्रा का ठहराव पर भरोसा करते हैं, जो उपयोग किया जाता है. मोटे तौर पर प्रयोग किया जाता है, इन तकनीकों प्रोटीन प्रति ईवी मतभेद के लिए खाते में नहीं है, और ईवीएस में प्रोटीन समुच्चय और प्रोटीन contaminating के बीच भेदभाव नहीं करते. इसके अलावा, इन तकनीकों के कई मामलों में जैविक नमूने में ईवी सांद्रता की तुलना असंभव बना देता है जो ईवीएस के अलगाव की आवश्यकता होती है.
इसलिए, प्रयासों और अधिक सटीक और प्रत्यक्ष ईवी माप 10 के लिए अनुमति देते हैं कि उपन्यास तरीकों को विकसित करने के लिए किए जाते हैं. यह रिपोर्ट विश्वसनीय मात्रा का ठहराव और ईवीएस के आकार की रूपरेखा के लिए ट्यून करने योग्य प्रतिरोधक पल्स संवेदन (टीआरपी) के उपयोग का वर्णन करता है.
वर्तमान में, qNano साधन (चित्रा 1 ए) टीआरपी के लिए केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मंच है. टीआरपी में, एक गैर प्रवाहकीय लोचदार झिल्ली वाई punctuatedएक नैनो आकार ताकना वें दो तरल पदार्थ कोशिकाओं को अलग किया जाता है. अन्य सेल कण मुक्त इलेक्ट्रोलाइट से भर जाता है, जबकि तरल पदार्थ कोशिकाओं में से एक, ब्याज का नमूना से भर जाता है. एक वोल्टेज लागू करके, एक आयनिक प्रवाह / विद्युत प्रवाह ताकना के माध्यम से कणों के स्थानांतरण पर बदल जाता है, जो (चित्रा 1 बी) की स्थापना की है. इस वर्तमान नाकाबंदी ('प्रतिरोधक पल्स') का परिमाण कण 11 (चित्रा -1 सी) की मात्रा के लिए आनुपातिक है. नाकाबंदी अवधि में इस तरह के आरोप या 12 आकार के रूप में कण विशेषताओं पर निर्भर करता है जो कणों की जीटा संभावित, का आकलन किया जा सकता है. अज्ञात कणों के आकार की रूपरेखा एक ज्ञात व्यास के साथ अंशांकन कणों की वजह से प्रतिरोधक दालों के साथ अज्ञात कणों की वजह से प्रतिरोधक दालों की तुलना द्वारा किया जा सकता है. एक नाकाबंदी घटना की भयावहता इसके अलावा, इन होती है जो की दर को मापा जाता है. इस गणना दर धर्मकण एकाग्रता पर तों. एकाग्रता और blockades की दर ज्ञात एकाग्रता और कण आकार के कणों के साथ एक एकल अंशांकन नमूना का उपयोग, रैखिक 13 आनुपातिक चूंकि एकाग्रता 14 और एक अज्ञात नमूना के आकार के वितरण 11 की माप के लिए अनुमति देता है.
nanopore के माध्यम से कणों के आंदोलन इलेक्ट्रो kinetic- (electrophoretic और विद्युत आसमाटिक) और fluidic बलों 15 से निर्धारित होता है. चर दबाव मॉड्यूल (VPM) तरल पदार्थ कोशिकाओं के बीच एक अंतर दबाव का उपयोग करके एक अतिरिक्त बल के रूप में प्रेरित किया जा सकता है. सकारात्मक दबाव लागू कण एकाग्रता कम होने पर लाभ हो सकता है जो कणों के प्रवाह की दर बढ़ जाती है. इसके अलावा, दबाव विद्युत गतिज ताकतों के प्रभाव को कम करने के लिए लागू किया जा सकता है. एक रिश्तेदार छोटे ताकना व्यास के साथ nanopores का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है (NP100, संभवतः NP150 और NP200) के रूप में अक्सर ईवीएस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया.इन nanopores के लिए, महत्वपूर्ण दबाव लागू करने, तब भी जब विद्युत गतिज बलों, कण सतह आरोप के आधार पर, 16 nonnegligible रह सकते हैं. कई दबाव में कण दर को मापने के द्वारा, एक विद्युत kinetically सही, और इस प्रकार अधिक सटीक, ईवी एकाग्रता की गणना की जा सकती है.
इधर, विस्तृत प्रोटोकॉल ईवीएस के आकार के वितरण और एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए प्रदान की जाती हैं. नमूने ज्ञात आकार और एकाग्रता की 17 polystyrene मोती के साथ नुकीला कर रहे हैं जहां नियमित संचालन प्रोटोकॉल के आगे, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण वर्णन किया गया है. यह वास्तविक समय अंशांकन तकनीक ऐसी मूत्र, प्लाज्मा और सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला, या के रूप में जैविक तरल पदार्थ, में सीधे ईवीएस मापने जब तकनीकी चुनौतियों में से कुछ का सामना करना पड़ा पर काबू पाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता माप समय की एक लंबी अवधि में nanopore की स्थिरता नहीं हो सकता जब यह सुनिश्चित किया.
मात्रा का ठहराव और टीआरपी का उपयोग ईवीएस के आकार के लक्षण वर्णन के लिए इस पांडुलिपि के प्रस्ताव के तरीके में वर्णित प्रोटोकॉल. टीआरपी मंच का प्रमुख लाभ छोटा सा नमूना आकार, सापेक्ष कम माप अवधि और आवश्यक नमूना हेरफेर के अभाव हैं.
सटीक टीआरपी मापन के लिए शर्त अंशांकन और नमूना माप के बीच समान शर्तों रखने के लिए है. यह समान buffers के उपयोग के साथ ही इस तरह के nanopore आकार, वोल्टेज और लागू दबाव के रूप में समान साधन सेटिंग्स, शामिल हैं. मूल VPM जिससे नमूनों के बीच लागू दबाव में मामूली अंतर के कारण लागू दबाव का सही स्थापित करने के लिए एक तंत्र का अभाव है. अलग समय बिंदुओं पर मापने इसके अलावा, जब VPM में भड़काना तरल पदार्थ का वाष्पीकरण मामूली दबाव मतभेद पैदा कर सकते हैं और VPM इसलिए अक्सर फिर से primed किया जाना चाहिए. इन सीमाओं के संभावित VPM2, के लागू होने से हल किया गया है जोएक क्लिक के आधार पर स्केलिंग है और हवा के दबाव आधारित है.
इस पांडुलिपि में वर्णित वैकल्पिक प्रोटोकॉल गैर शुद्ध जैविक नमूने 17 में ईवीएस की माप के लिए विशेष रूप से अनुकूल है. हम ऐसे शर्करा, लिपिड, प्रोटीन और कुछ मामलों में कर सकते हैं, अन्य बड़े मलबे के रूप में बफर घटकों, लागू होने के लिए मानक प्रोटोकॉल के लिए बहुत ज्यादा माप की स्थिति को प्रभावित करता है. नमूना के बजाय दो अलग माप की तुलना करने के लिए अंशांकन मोतियों के अलावा 'वास्तविक समय अंशांकन' का परिचय. अलग और / या अज्ञात fluidic पृष्ठभूमि सामग्री है कि नमूने (विभिन्न दानदाताओं की जैसे रक्त प्लाज्मा) की तुलना करते समय इस विधि विशेष रूप से उपयुक्त है. मतभेद ईवीएस और polystyrene कणों (जैसे कण घनत्व और सतह प्रभार), सैद्धांतिक मॉडल के रूप में अच्छी तरह से प्रयोगात्मक डेटा के बीच मौजूद हालांकि मात्रा का ठहराव और ईवीएस के आकार की रूपरेखा के लिए polystyrene मोती के प्रयोज्य को रेखांकित,शर्त के तहत कि महत्वपूर्ण दबाव 15,19 लागू किया जाता है. Electrokinetic ताकतों के प्रभाव को कम करने के लिए, अपेक्षाकृत बड़ा NP150 / NP200 nanopore और महत्वपूर्ण सकारात्मक दबाव के उपयोग की सलाह दी है.
ईवीएस और अंशांकन मोती आकार द्वारा प्रतिष्ठित हैं. नतीजतन, nanopore ईवीएस और बड़ा अंशांकन कणों दोनों का पता लगाने में मनाया जाता है, जहां एक व्यास, खिंचाव लगाने से खोला जाना है. ताकना के उद्घाटन के छोटे कणों के प्रति संवेदनशीलता कम हो जाएगा, केवल दर्ज कर रहे हैं एक निश्चित आकार (अक्सर ईवीएस> 120 एनएम एक 335 एनएम अंशांकन मनका का उपयोग करते समय) से बड़ा ईवीएस. ईवीएस के लिए न्यूनतम सीमा का पता लगाने के लिए एक NP150 nanopore पर 203 एनएम अंशांकन मोती का उपयोग, लगभग 90 एनएम तक की कमी की जा सकती है. बड़ा ईवीएस nanopore की लगातार clogging प्रेरित हालांकि, जब इस स्थापना अलाभकारी हो सकता है. इन निरोधक ईवीएस की उपस्थिति एक सेटअप के उपयोग के लिए मजबूर हो सकता है, जहां इसकी वजह के लिए बहुत छोटा ईवीएस की आबादी,पता लगाने सीमा CH, पता नहीं होगा.
आकार में 100 एनएम से छोटे कणों को मापने की कोशिश कर रहा है जब कठिनाई प्रणाली बढ़ जाती है संचालित करने के लिए. ऐसे मामलों में, पता लगाने इलेक्ट्रोलाइट का नमक एकाग्रता में वृद्धि से सुधार किया जा सकता है. एक बढ़ा आयन एकाग्रता छोटे कणों के लिए अपेक्षाकृत वृद्धि की नाकाबंदी परिमाण (बड़ा संकेत करने वाली शोर अनुपात) को उत्पन्न करेगा. ईवीएस की माप के लिए इस तकनीक की व्यवहार्यता वृद्धि हुई नमक सांद्रता ईवीएस की मात्रा को प्रभावित कर सकते हैं, हालांकि मान्य किया गया है.
अंत में, टीआरपी मंच प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव और ईवीएस के आकार के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कोई अलगाव या EV हेरफेर (एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट लेबलिंग) की आवश्यकता है के बाद से, मंच जैविक तरल पदार्थ में प्रत्यक्ष ईवी मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त है. एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल बफर घटक महत्वपूर्ण ताकना cloggin प्रेरित जहां नमूने के लिए फायदेमंद हो सकता है कि प्रदान की जाती हैअलाभकारी मानक प्रोटोकॉल के विश्वसनीय उपयोग कर रही जी घटनाओं,.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |