Vesículas extracelulares desempenham papéis importantes em processos fisiológicos e patológicos, incluindo a coagulação, as respostas imunes e cancro ou como agentes terapêuticos potenciais na entrega da droga ou medicina regenerativa. Este protocolo apresenta métodos para a quantificação e caracterização tamanho de vesículas extracelulares isolados e não-isolados em vários fluidos usando ajustável sensor de pulso resistiva.
Vesículas extracelulares (SVE), incluindo 'microvesículas' e 'exossomos ", são muito abundantes em fluidos corporais. Nos últimos anos temos assistido a um tremendo aumento no interesse em EVs. VE demonstraram desempenhar um papel importante em vários processos fisiológicos e patológicos, incluindo a coagulação, as respostas imunes e cancro. Além disso, VE têm potencial como agentes terapêuticos, por exemplo, como veículos de entrega de drogas, ou como a medicina regenerativa. Por causa de seu pequeno tamanho (50 a 1000 nm) quantificação precisa e tamanho de perfis de EVs é tecnicamente desafiador.
Este protocolo descreve como sintonizável de detecção de impulsos tecnologia resistiva (PG), utilizando o sistema de qNano, pode ser utilizado para determinar a concentração e tamanho de veículos eléctricos. O método, que se baseia na detecção de veículos eléctricos sobre a sua transferência através de um poro de tamanho nanométrico, é relativamente rápido, é suficiente a utilização de pequenos volumes de amostra e não requer a purificação e concentração de EVs. Próxima ao protocolo de funcionamento regular de uma abordagem alternativa é descrita usando amostras contendo esferas de poliestireno de tamanho e concentração conhecida. Este tempo real técnica de calibração podem ser utilizadas para superar problemas técnicos encontrados quando os VE medindo directamente em fluidos biológicos.
As vesículas de origem celular são muito abundantes nos fluidos corporais 1. Essas vesículas chamadas extracelulares (VE) (50 – 1000 nm em tamanho) são formados por fusão de corpos ou de multi-vesicular com a membrana celular ou por brotamento directo no exterior da membrana celular. Nos últimos anos, o interesse científico em EVs aumentou consideravelmente, resultando em uma infinidade de publicações com foco no EV, em que novas funções e características de EVs são descritos 1. VE estão agora acreditava estar envolvido numa grande variedade de processos fisiológicos e patológicos tais como a transdução de sinal, regulação imune, e a coagulação do sangue 1-4. No cancro, VE parecem desempenhar um papel na formação de nichos premetastatic 5,6, transferência de conteúdo pró-canceroso 7,8 e estimulação da angiogénese 8. Além disso, VE são explorados como agentes de entrega de agentes terapêuticos 9.
Apesar destes developments, quantificação confiável de EVs continua sendo um desafio. Tradicionalmente, são utilizados métodos de quantificação indiretos, que contam com a quantificação do teor de proteína total ou proteínas específicas. Embora amplamente utilizado, estas técnicas não são responsáveis por diferenças proteína-per-EV, e não discriminam entre contaminando agregados proteicos e proteínas em EVs. Além disso, essas técnicas requerem isolamento de veículos eléctricos, que em muitos casos torna a comparação das concentrações de VE em amostras biológicas impossível.
Portanto, os esforços são empreendidos para desenvolver novos métodos que permitem a medição EV mais precisa e direta 10. Este relatório descreve o uso de sensoriamento pulso ajustável resistiva (TRP) para a quantificação confiável e tamanho de perfis de EVs.
Actualmente, o qNano instrumento (Figura 1a) é a plataforma única disponível comercialmente para PG. Em TRP, uma membrana elástica não-condutor pontuado with um poro de tamanho nano está separando duas células do líquido. Uma das células do fluido é enchido com a amostra de interesse, enquanto que a outra célula é preenchido com electrólito livre de partículas. Através da aplicação de uma tensão, uma / fluxo de corrente eléctrica é estabelecida iónico, que é alterado no momento da transferência das partículas através do poro (Figura 1b). A magnitude deste bloqueio actual ('pulso resistiva') é proporcional ao volume da partícula 11 (Figura 1c). A duração do bloqueio pode ser utilizada para avaliar o potencial zeta das partículas, que se baseia em características das partículas, tais como a carga ou a forma 12. Tamanho das partículas de perfis desconhecidos pode ser realizada por comparação dos impulsos resistivos causadas pelas partículas desconhecidas, com os impulsos de resistivos causadas por partículas de calibração com um diâmetro conhecido. Além da magnitude de um evento de bloqueio, a taxa de que estes ocorrem é medido. Esta taxa contagem relies relativas a concentração de partículas. Uma vez que a concentração e taxa de bloqueios são linearmente proporcional 13, usando uma única amostra de calibração com partículas de concentração conhecida e tamanho de partícula permite a medição da concentração de 14 e 11 de distribuição de tamanho de uma amostra desconhecida.
O movimento das partículas através do nanoporo é determinado por electro kinetic- forças electroforéticas (e electro-osmótico) e fluidos 15. Ao utilizar o módulo de pressão variável (VPM) de uma diferença de pressão entre as células do líquido pode ser induzida como uma força adicional. Aplicando pressão positiva aumenta a taxa de fluxo de partículas, o que pode ser benéfico quando a concentração das partículas é baixa. Além disso, a pressão pode ser aplicada para reduzir o efeito das forças de electro-cinético. Isto é especialmente importante quando se utiliza nanoporos com diâmetro pequeno em relação poro (NP100, NP150 e NP200 possivelmente) utilizado com freqüência para a detecção de EVs.Para esses nanoporos, mesmo quando se aplica uma pressão significativa, as forças eletro-cinética pode, dependendo da carga da superfície da partícula, permanecem nonnegligible 16. Através da medição da taxa de partículas em várias pressões, uma electro-cinético corrigido, e, portanto, mais precisos, a concentração EV pode ser calculado.
Aqui, os protocolos detalhados são fornecidos para determinar a distribuição do tamanho e concentração de veículos eléctricos. Junto ao protocolo de funcionamento regular, uma abordagem alternativa é descrito onde as amostras são incrementadas com esferas de poliestireno de tamanho e concentração de 17 conhecido. Esta técnica de calibração em tempo real pode ser utilizado para ultrapassar alguns dos problemas técnicos encontrados quando se mede os VE directamente em fluidos biológicos, tais como urina, plasma e sobrenadante de cultura celular, ou quando a estabilidade do nanoporo durante um longo período de tempo de medição não pode ser assegurada.
Os protocolos descritos neste metodologias oferta manuscrito para quantificação e caracterização do tamanho de EVs usando TRP. As principais vantagens da plataforma TRP são o pequeno tamanho da amostra, duração da medição relativamente curto ea ausência de manipulação de amostra necessário.
Pré-requisito para a medição TRPS preciso é manter condições idênticas entre calibração e amostras de medições. Isso engloba o uso de tampões idênticos, bem como as configurações do instrumento idênticas, tais como tamanho nanoporos, tensão e pressão aplicada. O VPM inicial carece de um mecanismo de ajuste exacto da pressão aplicada, fazendo assim com que pequenas diferenças na pressão aplicada entre as amostras. Além disso, a evaporação do fluido de escorvamento no VPM pode induzir pequenas diferenças de pressão quando a medição em diferentes pontos de tempo e, por conseguinte, o VPM deve frequentemente ser re-condicionadas. Estas limitações foram potencialmente resolvidos pela introdução do VPM2, quetem um aumento de escala baseado clique, e baseia-se pressão de ar.
O protocolo alternativo descrito neste artigo é particularmente adequado para a medição de VE em amostras biológicas não purificadas 17. Acreditamos que os componentes do tampão, tais como, açúcares, lípidos, proteínas e outros detritos maiores, pode, em alguns casos, influenciar as condições de medição demais para o protocolo padrão a ser aplicável. A adição de contas de calibração para a amostra em vez de comparar duas medidas separadas introduz 'calibração em tempo real ". Este método é especialmente adequado quando se comparam as amostras (por exemplo, plasma de sangue de dadores diferentes que têm diferentes) e / ou desconhecidos conteúdo fundo fluídicos. Embora existam diferenças entre os EVs e partículas de poliestireno (por exemplo, densidade de partículas e de carga superficial), modelos teóricos, bem como dados experimentais ressaltam a usabilidade de esferas de poliestireno para a quantificação eo tamanho de perfis de EVs,sob a condição de que a pressão é aplicada significativa 15,19. Para minimizar a influência de forças eletrocinéticos, o uso do relativamente maior NP150 / NP200 nanoporos e pressão positiva significativa é aconselhável.
EVs e contas de calibração são distinguidos pelo tamanho. Por conseguinte, o nanoporo tem de ser aberto por aplicação de estiramento, para um diâmetro, onde é observada a detecção de ambos os veículos eléctricos e as partículas maiores de calibração. Uma vez que a abertura do poro irá diminuir a sensibilidade em relação a partículas mais pequenas, só EVS maior do que um certo tamanho está gravado (geralmente VE> 120 nm, quando se utiliza um cordão de calibração 335 nm). O limite mínimo de detecção de veículos eléctricos pode ser reduzida para cerca de 90 nm, utilizando 203 nm em grânulos de calibragem de um nanoporo NP150. No entanto, essa configuração pode ser inviável quando EVs maiores induzir obstrução freqüente do nanopore. A presença destes VE obstruindo pode obrigar à utilização de uma configuração em que uma população de VE, demasiado pequena para reach o limiar de detecção, e não será detectado.
A dificuldade de operar o sistema aumenta quando se tenta medir partículas menores do que 100 nm em tamanho. Em tais casos, a detecção pode ser melhorada aumentando a concentração de sal de electrólito. Um aumento da concentração de iões irão induzir o aumento relativamente grandezas bloqueio de partículas pequenas (maior relação sinal-ruído). A viabilidade desta técnica para medições de EVs tem de ser validado, porém, como concentrações elevadas de sal pode influenciar o volume de EVs.
Em conclusão, a plataforma de PG pode ser utilizado para a quantificação directa e caracterização do tamanho do VE. Uma vez que não é necessário qualquer isolamento ou manipulação VE (anticorpo rotulagem de ligação ou fluorescente), a plataforma é adequado para a quantificação directa VE em fluidos biológicos. Um protocolo alternativo está previsto que pode ser benéfico para as amostras em que os componentes do tampão induzir cloggin poro significativaeventos g, tornando a utilização segura do protocolo padrão inviável.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |