T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석
Summary
정적 점착 분석은 T 림프구 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용될 수있는 강력한 도구이다. 상호 작용 플레이트 판독기가 직렬 세척 다음 부착 세포의 수를 정량화하는 데 사용되는 반면, 부착 분자로 코팅 된 웰에 표지 된 T 세포를 주입함으로써 생성된다.
Abstract
T 림프구의 접착 염증과 항원 제시 세포와 면역 시냅스의 형성 사이트로 이동을 포함하여 다수의 T 세포 기능이 필요합니다. T 세포는 인테그린, 파트너 세포 나 세포 외 매트릭스에서 표적 분자와 상호 작용하는 막 횡단 단백질의 이종이 쌍으로 이루어지는 세포 접착 분자의 수준의 접착 성을 제어함으로써 조절 된 접착을 달성. 가장 눈에 띄는 T 세포 인테는 그 대상 세포 접착 분자 (ICAM) -1 소단위 αL 및 β2, 구성, 림프구 기능 관련 항원 (LFA) -1이다. 접착 성을 제어하는 T 세포의 능력은 각각의 인테그린의 궁합 상태를 조절하는 능력에서 유래. 인사이드 아웃 신호는 세포 내부 신호가 인테그린의 외부 도메인이 활성화 된 상태를 가정하는 원인이된다 과정에 대해 설명합니다. 이러한 복잡한 현상에 대한 우리의 지식의 대부분은 기계 론적 기반으로연구는 체외 모델 시스템의 단순화에서 수행. 여기에 설명 된 T 림프구 접착 분석은 T 세포가 정적 조건 하에서, 표적 분자에 부착 허용하고 점착성을 정량화하는 형광 플레이트 판독기를 이용하여 우수한 공구이다. 이 분석은 림프구에 작용 접착 자극 또는 억제 물질을 정의뿐만 아니라 관련된 시그널링 이벤트 특성화에 유용왔다. LFA-1에 여기에서 설명하지만 – ICAM-1 매개 접착; 이 분석은 용이하게 다른 접착제 상호 작용 (- 피브로넥틴 예 VLA-4)의 조사를 허용하도록 구성 될 수있다.
Introduction
T 림프구의 접착은 면역 반응 1에 근본적인 과정이다. 그것은 주사 항원 표적 세포 (2)와 림프절 내의 세포 (APC)를 제시하고, 면역 시냅스 형성 (IS)에 대한 내피 세포가 모세관 벽 장식과 T 세포 상호 작용을 위해 요구된다. 이러한 요구 사항은 기능과 역학적으로 구별된다. 림프구의 혈관 외 유출의 과정은 chemoattraction, 압연, 밀착성, 그리고 윤회로 구성되어 있습니다. 접착 성을 굳게하기 위해 롤링의 전환이 빠르게 G 단백질 결합 수용체의 신호에 응답하는 T 세포를 필요로합니다. 이 응답은 롤링 셀 3을 느리게하고 체포 인테 리간드 상호 작용을 얻을 수 있습니다. 인테 욕망의 즉각적인 변화는이 과정을 매개한다. 마이그레이션은 '프론트 엔드'에서 유착의 형성과 '후부'에서 유착의 파손 동적 상호 작용의 betweenTcells과 내피 세포가 필요합니다성형 및 4를 깨는 사이의 분 정도의 간격으로. IS는 inminutes를 형성하지만, 시간 6에 그대로 유지해야합니다.
흥미롭게도, 하나의 접착 분자는 인테그린 회원 림프구 기능 관련 항원 (LFA) – 1,이 모든 과정 5 필수적이다. LFA-1가 면역 글로불린 수퍼 패밀리의 다양한 구성원과의 상호 작용을 통해 부착을 매개한다. LFA-1로 가장 높은 선호도가 가장 광범위하게 연구 리간드는 세포 간 접착 분자 (ICAM) -1입니다. 비 활성화 순환 림프구 따라서 세포 표면에 LFA-1 및 ICAM-1-코팅 된 표면에 부착 할 수없는 낮은 선호도를 표현한다. LFA-1 궁합 변수와 같은 G 단백질 결합 수용체 활성화, 사이토킨 자극 및 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 매개되는 신호와 같은 여러 시그널링 이벤트에 의해 조절된다. LFA-1은 세포 외 공간에 세포 내 활성을 전달의 결과 선호도가 높은 포름 티ICAM-1의 hrough의 상호 작용. 이 통로는 7 신호 내부 아웃이라고한다. 마찬가지로, 세포 외 공간에서 LFA-1을 통해 신호는 외부에서 신호라고합니다.
인사이드 – 아웃 및 신호 외부 -에 참여 폭포 신호 세포는 현재의 연구의 주요 초점이다. 작은 GTPase의 RAP1는 최근 그 TCR 내고 8 신호 사이토 카인의 공통 신호 내부 아웃의 핵심 구성 요소로 떠오르고있다. T 세포 접착이 지배적 부정적인 RAP1 9의 발현에 의해 차단되는 반면 인테 활성화에 RAP1의 중요한 역할은, RAP1의 과발현은 T 세포의 인테 의존 접착을 자극 발견에 의해 강조 표시됩니다. RAP1으로 인테 규제에 대한 우리의 이해의 이러한 발전은 체외 도구로 사용하여 수행되었다. 그 중 여기에 설명 된 정적 접착 분석이다.
이 방법의 전반적인 목표는 T를 연구하는 것입니다ICAM-1 코팅 표면에 세포 접착. 구체적으로는 객관적으로 측정하고 다른 조건에서 실시간으로 살아있는 세포에서의 카운터 리간드쪽으로 LFA-1 친화력을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 기술은 T 세포와 상호 작용하는 세포 표면을 모방하는 ICAM-1로 코팅 폴리스티렌 웰을 사용한다. 많은 전술 정적 T 세포 부착 분석법 실험적 복잡한되었습니다. 주로 T 세포에 필요한 이러한 분석은 방사성 레이블 T 세포 접착 용 기판 등의 세포 외 기질 (extracellular matrix)을 만들 배양 소 각막 세포를 이용, 또는 T 세포 접착 (10)을 촉진하기 위해 확장 된 기간 동안 비 생리적 인 T 세포 자극을 요구한다. 많은 다른 분석 시스템 (11)에서 이용되는 것처럼, 계측법 및 현미경 흐르게 비해 접착 배양 다음 T 세포를 정량화하는 형광 측정의 사용은 정량보다 민감하고 정확한 방법이다. 또한, 단일 세포 microscop인테그린 지역화 IC 분석은 형광 측정과 동일한 방식으로 광범위한 인구 기반 분석을 허용하지 않는다. 활성화 상태 별 LFA-1 항체가 상업적으로 사용할 수 있지만,이 항체는 여기에 설명 된 방법에 상대적으로 낮은 감도를 제공합니다. 대체 기술을 통해 가장 큰 장점은 단순하고 동시에 여러 실험 조건을 검사 할 수있는 기능입니다. 특정 응용 프로그램에 대해이 방법을 고려할 때, 하나는 T 세포가 부정적으로 선택한 갓 격리 및 형광 마커로 표시되어야 함을 고려한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
LFA-1의 활성화 및 T 세포 접착 (12)에 신호를 연구하는 몇 가지 분석이있다. 유동 세포 계측법은 절곡 또는 LFA-1 확장 하나에 선택적으로 결합 모노클로 날 항체를 사용하여 살아있는 세포에 LFA-1의 궁합 상태를 측정하는 데 사용된다. 이 방법의 한계 중 하나는 계정에 인테그린 '갈망을하지 않는다는 것입니다. 마이그레이션 분석은 유용한 도구입니다 있지만 특정 시점에서 순대 접착을?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil 신뢰, 마이클 Saperstein 의료 학자 연구 자금 및 NYU 화이트 헤드의 교제는이 작업을 지원했다.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
Referências
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
