Static adhæsionsassayet for Studiet af Integrin Aktivering i T-lymfocytter
Summary
Statisk adhæsionsassay er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at modellere interaktioner mellem T-lymfocytter og andre celletyper. Interaktioner genereres ved at injicere mærkede T-celler i brønde overtrukket med adhæsionsmolekyler, mens en pladelæser anvendes til at kvantificere antallet af adhærente celler efter seriel vask.
Abstract
T-lymfocyt-adhæsion kræves for flere T-celle-funktioner, herunder migration til steder med inflammation og dannelse af immunologiske synapser med antigenpræsenterende celler. T-celler opnå reguleret adhæsion ved at styre de adhæsive egenskaber af integriner, en klasse af celleadhæsionsmolekyler, som består af heterodimere par transmembrane proteiner, der interagerer med målmolekylerne på partner celler eller ekstracellulære matrix. Den mest fremtrædende T-celle-integrin lymfocytfunktion-associeret antigen (LFA) -1, sammensat af underenheder αL og β2, hvis mål er det intracellulære adhæsionsmolekyle (ICAM) -1. Evnen af et T-celle til at kontrollere vedhæftning stammer fra evnen til at regulere affinitet stater enkelte integriner. Inside-out signalering beskriver den proces, hvorved signaler inde i en celle forårsage eksterne domæner af integriner til at påtage sig en aktiveret tilstand. Meget af vores viden om disse komplekse fænomener er baseret på mekanistiskeundersøgelser udført i forenklet in vitro modelsystemer. T lymfocytadhæsion assay beskrevet her er et fremragende værktøj, der giver T-celler til at overholde målrette molekyler, der under statiske forhold, og derefter benytter en fluorescenspladelæser at kvantificere klæbeevne. Denne analyse har været nyttigt at definere vedhæftning-stimulerende eller hæmmende stoffer, der reagerer på lymfocytter, samt karakterisering af signaleringshændelser involverede. Selvom beskrevet her for LFA-1 – ICAM-1 medieret friktion; dette assay kan let tilpasses for at tillade undersøgelse af andre adhæsive interaktioner (fx VLA-4 – fibronectin).
Introduction
T-lymfocyt-adhæsion er en fundamental proces i immunresponset 1. Det er nødvendigt for T-celle-interaktion med endotelceller dekoration kapillærvæggene, til scanning antigenpræsenterende celler (APC) i lymfekirtler og til dannelse af immunologiske synapser (IS) med målceller 2. Disse krav er funktionelt og kinetisk tydelig. Processen af lymfocytter ekstravasation består af kemotiltrækning, valsning, fast vedhæftning, og sjælevandring. Overgangen fra ruller til fast vedhæftning kræver T-celler til at reagere på en G-proteinkoblet receptor signal hurtigt. Denne reaktion giver en integrin ligand vekselvirkning, som bremser og anholdelser den rullende celle 3.. En umiddelbar ændring i integrin aviditet medierer denne proces. Migration kræver dynamiske vekselvirkninger betweenTcells og endotelceller med dannelsen af sammenvoksninger på "frontend" og brud på sammenvoksninger på "bagende"med et interval på omkring et minut mellem formning og bryde 4.. IS danner inminutes, men skal forblive intakt i timevis 6.
Interessant, et adhæsionsmolekyle, integrinfamilien medlem lymfocytfunktion associeret antigen (LFA) – 1, er afgørende for alle disse processer 5. LFA-1 medierer adhæsion gennem interaktioner med flere medlemmer af immunglobulin-superfamilien. Den mest omfattende undersøgte ligand med den højeste affinitet til LFA-1 er det intercellulære adhæsionsmolekyle (ICAM) -1. Ikke-aktiverede cirkulerende lymfocytter udtrykker lav affinitet LFA-1 på celleoverfladen og derfor er ude af stand til at klæbe til ICAM-1-overtrukne overflader. LFA-1-affinitet er variabel og reguleret af flere signaling begivenheder såsom G-protein koblet receptor aktivering, cytokinstimulering og signaler medieret af T-cellereceptorer (TCR). Den resulterende høj affinitet form af LFA-1 formidler intracellulær aktivering til det ekstracellulære rum through interaktioner med ICAM-1. Denne vej kaldes inside-out signalering 7.. Ligeledes signalering via LFA-1 fra det ekstracellulære rum kaldes udefra-ind signalering.
Den intracellulære signalering kaskader involveret i inside-out og outside-in signalering er en stor fokus på aktuel forskning. Den lille GTPase RAP1 har for nylig vist sig som den centrale del af inside-out signalerer, at der er fælles for både TCR ligatur og cytokin signalering 8. Den kritiske rolle RAP1 i integrin aktivering er fremhævet af den opdagelse, at overekspression af RAP1 stimulerer integrin-afhængig adhæsion af T-celler, hvorimod T-celle adhæsion er blokeret ved ekspression af dominant negativ RAP1 9. Disse fremskridt i vores forståelse af integrin regulering af RAP1 er blevet gennemført ved hjælp af in vitro-værktøjer. Blandt dem er den statiske adhæsionsassay beskrevet her.
Det overordnede mål med denne metode er at studere Tcelle klæbeevne til ICAM-1-overtrukne overflader. Mere specifikt er det bruges til objektivt at måle og kvantificere LFA-1 affinitet mod sin counter ligander i levende celler på realtid, under forskellige forhold. Denne teknik bruger polystyrenbrønde overtrukket med ICAM-1 til at efterligne de cellulære overflader, som T-celler interagerer med. Mange tidligere beskrevne statiske T-celle adhæsionsassays var eksperimentelt kompleks. Disse assays ofte nødvendige for T-celler til at blive radioaktivt mærket, anvendes dyrkede bovine hornhindeceller at skabe en ekstracellulær matrix som substrat for T-celle-adhæsion eller krævet ikke-fysiologiske T-celle-stimulation over en længere varighed for at fremme T-celleadhæsion 10. Anvendelsen af fluorometrisk måling kvantificere T-celler efter vedhæftningen inkubation er en mere følsom og nøjagtig metode til kvantificering i forhold til flowcytometri og mikroskopi, som er brugt i mange andre assaysystemer 11. Derudover enkelt celle microscopic-analyse af integrin lokalisering ikke giver mulighed for den brede, befolkning baseret analyse på samme måde som den fluorometriske måling. Mens aktivering state-specifikke LFA-1-antistoffer er kommercielt tilgængelige, er disse antistoffer har lav følsomhed i forhold til fremgangsmåden beskrevet her. Den største fordel i forhold til andre teknikker, er dens enkelthed og mulighed for at undersøge flere eksperimentelle betingelser samtidig. Når man overvejer denne metode til en specifik anvendelse, bør man tage hensyn til, at T-celler skal være negativt valgt, frisk isolerede, og mærket med en fluorescerende markør.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere assays for at studere signaler til LFA-1-aktivering og T-celle-adhæsion 12. Flowcytometri anvendes til at måle LFA-1 affinity stater i levende celler under anvendelse af monoklonale antistoffer, der binder selektivt til enten bøjet eller forlænges LFA-1. En af begrænsningerne ved denne metode er, at den ikke tager hensyn til de integriner 'aviditet. Migration assays er nyttige redskaber, men de måler migration, og ikke sølle vedhæftning på et bestemt tidspunkt. Musemodeller at studer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Scholars forskningsmidler og NYU Whitehead fællesskab støttet dette arbejde.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
Referências
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
