Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten
Summary
Statischen Adhäsionsassay ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und andere Zelltypen zu modellieren. Interaktionen werden durch Injizieren markierten T-Zellen in Vertiefungen, die mit Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, während ein Plattenlesegerät verwendet wird, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu quantifizieren folgenden seriellen Waschungen erzeugt.
Abstract
T-Lymphozyten-Adhäsion wird für mehrere T-Zell-Funktionen, einschließlich der Migration zu Entzündungsstellen und die Bildung von immunologischen Synapsen mit Antigen präsentierenden Zellen erforderlich. T-Zellen zu erreichen geregelte Haftung durch Steuerung der Klebeeigenschaften von Integrinen, einer Klasse von Zelladhäsionsmolekülen aus heterodimeren Paare von Transmembranproteinen, die mit den Zielmolekülen wechselwirken auf Partnerzellen oder extrazelluläre Matrix. Der prominenteste T-Zell-Integrin Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen (LFA) -1, von Untereinheiten &agr; L und β2, deren Ziel die intrazelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1 besteht. Die Fähigkeit eines T-Zell-Adhäsion zu steuern leitet sich aus der Möglichkeit, die Affinitätszustände einzelner Integrine regulieren. Inside-Out-Signalisierung beschreibt die Verfahren, bei dem Signale in einer Zelle bewirken, dass die externe Domänen der Integrine in einen aktivierten Zustand übernehmen. Vieles von unserem Wissen über diese komplexen Phänomene auf mechanistische BasisStudien in vitro vereinfachten Modellsystemen durchgeführt. Die hier beschriebene T-Lymphozyten-Adhäsion Assay ist ein hervorragendes Werkzeug, die T-Zellen zu halten, um Moleküle unter statischen Bedingungen zielen, ermöglicht, und nutzt eine Fluoreszenzplattenlesegerät zu Haft dann quantifizieren. Dieser Assay wurde bei der Definition Haft stimulierende oder hemmende Substanzen, die auf Lymphozyten wirken, sowie die Charakterisierung der Signalwege beteiligt nützlich. Obwohl hier für LFA-1 beschrieben – ICAM-1 vermittelte Adhäsion; Dieser Assay kann leicht angepasst werden, um für die Untersuchung von anderen adhäsiven Wechselwirkungen (zB VLA-4 – Fibronektin) zu ermöglichen.
Introduction
T-Lymphozyten-Adhäsion ist ein fundamentaler Prozess der Immunantwort 1. Es ist für die T-Zell-Interaktion mit Endothelzellen, die Dekoration der Gefäßwände erforderlich ist, zum Abtasten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in die Lymphknoten und die für die Bildung von immunologischen Synapsen (IS) mit Zielzellen 2. Diese Anforderungen sind funktionell und kinetisch deutlich. Der Prozess der Lymphozyten-Extravasation besteht aus Chemoattraktion, Rollen, feste Adhäsion und Transmigration. Der Übergang von der rollenden Adhäsion festigen erfordert T-Zellen zu einer G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signal schnell zu reagieren. Diese Antwort ergibt einen Integrin-Ligand-Wechselwirkung, die Verhaftungen und verlangsamt den Rollzelle 3. Eine sofortige Änderung in der Integrin-Avidität vermittelt diesen Prozess. Migration erfordert dynamischen Wechselwirkungen betweenTcells und Endothelzellen mit der Bildung von Verwachsungen an der "Front-End" und Bruch von Adhäsionen in der "hinteren Ende"mit einem Intervall von etwa einer Minute zwischen Form-und Bruch 4. Der IS bildet inminutes, muss aber für 6 Stunden intakt bleiben.
Interessanterweise, ein Adhäsionsmolekül das Integrin Familienmitglied Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen (LFA) – 1 ist, wichtig für all diese Prozesse 5. LFA-1 vermittelt Adhäsion durch Interaktionen mit mehreren Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie. Die am besten untersuchten Liganden mit der höchsten Affinität an LFA-1 ist das interzelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1. Nicht-aktivierte zirkulierenden Lymphozyten exprimieren geringe Affinität LFA-1 auf der Zelloberfläche und sind daher nicht an ICAM-1-beschichteten Oberflächen anhaften. LFA-1-Affinität ist variabel und von mehreren Signalereignisse wie G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Aktivierung, Zytokin-Stimulation, und Signale, die von T-Zell-Rezeptoren (TCR) vermittelt geregelt. Die daraus resultierende hohe Affinität Form von LFA-1 fördert die intrazelluläre Aktivierung auf den extrazellulären Raum turch Wechselwirkung mit ICAM-1. Dieser Weg wird von innen nach außen bezeichnet Signal 7. Ebenso Signalgebung durch LFA-1 aus dem extrazellulären Raum außerhalb-der Signalisierung genannt.
Die intrazelluläre Signalkaskaden in Inside-out-und Outside-In-Signalübertragung beteiligt sind ein Schwerpunkt der aktuellen Forschung. Die kleine GTPase Rap1 hat vor kurzem als die Schlüsselkomponente der inside-out signalisiert, dass es üblich, sowohl TCR-Ligation und Zytokin-Signal 8. Die kritische Rolle in Rap1 Integrin-Aktivierung wird von der Entdeckung, dass eine Überexpression von Rap1 stimuliert Integrin-abhängige Adhäsion von T-Zellen markiert, während T-Zell-Adhäsion wird durch Expression von dominant-negativen Rap1 9 blockiert. Diese Fortschritte in unserem Verständnis der Integrin-Regulation durch Rap1 wurden mit in vitro-Tools durchgeführt. Unter ihnen ist der hier beschriebene statische Adhäsionsassay.
Das Ziel dieser Methode ist es, T studierenZellhaftfähigkeit an ICAM-1-beschichteten Oberflächen. Genauer gesagt, wird es verwendet, um objektiv zu messen und zu quantifizieren, LFA-1-Affinität zu seinem Gegenliganden in lebenden Zellen in Echtzeit, unter verschiedenen Bedingungen. Diese Technik verwendet Polystyrol Vertiefungen mit ICAM-1 beschichtet, um die Zelloberflächen, die die T-Zellen interagieren mit imitieren. Viele zuvor beschriebenen statischen T-Zell-Adhäsions-Assays wurden experimentell komplex. Diese Assays oft für T-Zellen erforderlich ist, um radioaktiv markiert werden kann, verwendet kultivierten Rinder-Hornhaut-Zellen eine extrazelluläre Matrix, als Substrat für die T-Zell-Adhäsion zu erzeugen, oder für nicht-physiologischen T-Zell-Stimulation über eine längere Dauer, um T-Zell-Adhäsion zu fördern 10 bezeichnet. Die Verwendung von fluorometrischen Messung an T-Zellen zu quantifizieren folgenden Haft Inkubation ist eine empfindliche und genaue Verfahren zur Quantifizierung verglichen mit Durchflusszytometrie und Mikroskopie fließen, wie sie in vielen Assaysystemen 11 verwendet. Zusätzlich einzelnen Zelle mikroskopischIC-Analyse von Integrin Lokalisation nicht für die breite Bevölkerung basierten Analyse in der gleichen Weise wie die fluorometrische Messung zu ermöglichen. Während Aktivierungszustand spezifische LFA-1-Antikörper sind kommerziell erhältlich, bieten diese Antikörper geringe Empfindlichkeit in Bezug auf die Methode, die hier skizziert. Der wesentliche Vorteil gegenüber alternativen Techniken ist die Einfachheit und die Fähigkeit, mehrere Versuchsbedingungen gleichzeitig zu untersuchen. Bei der Betrachtung dieser Verfahren für eine bestimmte Anwendung, sollte man berücksichtigen, dass T-Zellen sollten negativ gewählt werden, frisch isoliert und mit einem fluoreszierenden Marker markiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt verschiedene Tests, um Signale an LFA-1-Aktivierung und T-Zell-Adhäsion 12 studieren. Durchflusszytometrie wird verwendet, um LFA-1-Affinität Zustände in lebenden Zellen messen mit monoklonalen Antikörpern, die selektiv entweder gebogen oder verlängert LFA-1 zu binden. Eine der Einschränkungen dieser Methode ist, dass es nicht auf das Konto der Integrine 'Gier zu nehmen. Migration-Assays sind nützliche Werkzeuge, aber sie mickrige Haftung an einem bestimmten Zeitpunkt zu messen Migration, u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Wissenschaftler Forschungsgelder und die NYU Whitehead Gemeinschaft unterstützt diese Arbeit.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
Referências
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