टी lymphocytes में Integrin से सक्रियण के अध्ययन के लिए स्टेटिक आसंजन परख
Summary
स्टेटिक आसंजन परख टी lymphocytes और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत मॉडल का उपयोग किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण है. बातचीत एक प्लेट रीडर धारावाहिक washes निम्नलिखित पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या यों के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि आसंजन अणुओं के साथ लेपित कुओं में लेबल टी कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं.
Abstract
टी लिम्फोसाइट आसंजन सूजन और प्रतिजन कोशिकाओं के साथ प्रतिरक्षाविज्ञानी synapses के गठन की साइटों के लिए माइग्रेशन सहित कई टी सेल कार्यों के लिए आवश्यक है. टी कोशिकाओं integrins, साथी कोशिकाओं या बाह्य मैट्रिक्स पर लक्ष्य अणुओं के साथ बातचीत कि transmembrane प्रोटीन की heterodimeric जोड़े से मिलकर सेल आसंजन अणुओं के एक वर्ग के चिपकने वाली संपत्तियों को नियंत्रित द्वारा विनियमित आसंजन पूरा. सबसे प्रमुख टी सेल integrin जिसका लक्ष्य intracellular आसंजन अणु (ICAM) -1 है सब यूनिटों αL और β2, से बना, लिम्फोसाइट समारोह जुड़े प्रतिजन (LFA) -1 है. आसंजन नियंत्रित करने के लिए एक टी सेल की क्षमता व्यक्ति integrins की आत्मीयता राज्यों को विनियमित करने की क्षमता से निकला है. अंदर बाहर संकेतन एक कोशिका के अंदर संकेतों integrins की बाह्य डोमेन एक सक्रिय राज्य ग्रहण करने के लिए प्रेरित जिससे प्रक्रिया का वर्णन करता है. इन जटिल घटना के हमारे ज्ञान के बहुत यंत्रवत पर आधारित हैपढ़ाई के लिए इन विट्रो मॉडल प्रणाली में सरलीकृत में प्रदर्शन किया. यहाँ वर्णित टी लिम्फोसाइट आसंजन परख टी कोशिकाओं स्थिर शर्तों के तहत, अणु लक्ष्य का पालन करने की अनुमति देता है, और फिर चिपचिपाहट यों को एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग एक उत्कृष्ट उपकरण है. यह परख लिम्फोसाइटों पर कार्रवाई कि आसंजन-उत्तेजक या निरोधात्मक पदार्थों को परिभाषित है, साथ ही इसमें शामिल संकेत घटनाओं निस्र्पक में उपयोगी हो गया है. LFA-1 के लिए यहाँ वर्णित है – 1-ICAM मध्यस्थता आसंजन; इस परख आसानी से अन्य चिपकने वाला बातचीत (- फ़ाइब्रोनेक्टिन जैसे VLA-4) के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
Introduction
टी लिम्फोसाइट आसंजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 में एक मौलिक प्रक्रिया है. यह स्कैनिंग प्रतिजन कोशिकाओं लक्ष्य 2 के साथ लिम्फ नोड्स के भीतर कोशिकाओं (एपीसी) पेश, और प्रतिरक्षाविज्ञानी synapses के गठन के लिए (है) के लिए, endothelial कोशिकाओं केशिका दीवारों को सजाने के साथ टी सेल बातचीत के लिए आवश्यक है. इन जरूरतों को कार्यात्मक और kinetically अलग कर रहे हैं. लिम्फोसाइटों परिस्त्राव की प्रक्रिया chemoattraction, रोलिंग, फर्म आसंजन, और स्थानांतरगमन के होते हैं. आसंजन दृढ़ करने के लिए रोलिंग से संक्रमण तेजी से एक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर संकेत पर प्रतिक्रिया के लिए टी कोशिकाओं की आवश्यकता है. यह प्रतिक्रिया रोलिंग सेल 3 धीमा कर देती है और गिरफ्तारियां कि एक integrin ligand बातचीत पैदावार. Integrin उत्सुकता में एक तत्काल परिवर्तन इस प्रक्रिया मध्यस्थता करता है. माइग्रेशन 'सामने अंत' पर adhesions के गठन और 'रियर अंत' पर adhesions का टूटना साथ गतिशील बातचीत betweenTcells और endothelial कोशिकाओं की आवश्यकताबनाने और 4 तोड़ने के बीच के बारे में एक मिनट के अंतराल के साथ. IS inminutes रूपों, लेकिन 6 घंटे के लिए बरकरार रहने की जरूरत है.
दिलचस्प है, एक आसंजन अणु, Integrin परिवार के सदस्य लिम्फोसाइट समारोह जुड़े प्रतिजन (LFA) – 1, इन सभी प्रक्रियाओं 5 के लिए आवश्यक है. LFA-1 immunoglobulin superfamily के कई सदस्यों के साथ बातचीत के माध्यम से आसंजन मध्यस्थता करता है. LFA-1 को उच्चतम आत्मीयता के साथ सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन ligand कहनेवाला आसंजन अणु (ICAM) है -1. गैर सक्रिय परिसंचारी लिम्फोसाइटों इसलिए कोशिका की सतह पर LFA-1, और ICAM-1 में लिपटे सतहों का पालन करने में असमर्थ हैं कम आत्मीयता व्यक्त करते हैं. LFA-1 आत्मीयता चर और इस तरह जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर सक्रियण, साइटोकाइन उत्तेजना, और टी सेल रिसेप्टर्स (TCR) द्वारा मध्यस्थता संकेतों के रूप में कई संकेत घटनाओं द्वारा विनियमित है. LFA-1 बाह्य अंतरिक्ष के लिए intracellular सक्रियण बता देते हैं जिसके परिणामस्वरूप उच्च आत्मीयता प्रपत्र टीICAM-1 के साथ hrough बातचीत. इस मार्ग में 7 संकेत अंदर बाहर करार दिया है. इसी तरह, बाह्य अंतरिक्ष से LFA-1 के माध्यम से संकेत बाहर में संकेत कहा जाता है.
अंदर बाहर में और संकेतन बाहर में शामिल Cascades संकेत intracellular वर्तमान शोध का एक प्रमुख ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. छोटे GTPase Rap1 कि हाल ही में TCR बंधाव और 8 संकेत साइटोकाइन दोनों के लिए आम है संकेत के अंदर से बाहर की प्रमुख घटक के रूप में उभरा है. टी सेल आसंजन प्रमुख नकारात्मक Rap1 9 की अभिव्यक्ति से बंद है जबकि integrin सक्रियण में Rap1 की महत्वपूर्ण भूमिका है, Rap1 की overexpression टी कोशिकाओं की integrin निर्भर आसंजन को उत्तेजित करता है कि खोज से प्रकाश डाला है. Rap1 द्वारा integrin विनियमन की हमारी समझ में इन अग्रिमों विट्रो उपकरण में उपयोग कर पूरा किया गया है. उनमें से यहाँ वर्णित स्थिर आसंजन परख है.
इस विधि के समग्र लक्ष्य टी अध्ययन करने के लिए हैICAM-1 में लिपटे सतहों को सेल चिपचिपाहट. अधिक विशेष रूप से, यह निष्पक्ष मापने के लिए और अलग अलग परिस्थितियों में, वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं में अपने काउंटर ligands की ओर LFA-1 आत्मीयता यों के लिए प्रयोग किया जाता है. इस तकनीक टी कोशिकाओं के साथ बातचीत कि सेलुलर सतहों की नकल करने ICAM-1 के साथ लेपित polystyrene कुओं का उपयोग करता है. कई पहले से वर्णित स्थिर टी सेल आसंजन assays प्रयोगात्मक जटिल थे. अक्सर टी कोशिकाओं के लिए आवश्यक इन assays radioactively, लेबल टी सेल आसंजन के लिए सब्सट्रेट के रूप में एक बाह्य मैट्रिक्स बनाने के लिए सुसंस्कृत गोजातीय कार्निया कोशिकाओं का उपयोग किया, या टी सेल आसंजन 10 को बढ़ावा देने के लिए एक विस्तारित अवधि के दौरान गैर शारीरिक टी सेल उत्तेजना के लिए बुलाया जाएगा. कई अन्य परख सिस्टम 11 में उपयोग किया जाता है, के रूप में cytometry और माइक्रोस्कोपी प्रवाह की तुलना में आसंजन ऊष्मायन के बाद टी कोशिकाओं यों तो fluorometric माप का उपयोग मात्रा का ठहराव का एक और अधिक संवेदनशील और सही तरीका है. इसके अतिरिक्त, एकल कोशिका microscopintegrin स्थानीयकरण के आईसी विश्लेषण fluorometric माप के रूप में उसी तरह से व्यापक, जनसंख्या आधारित विश्लेषण के लिए अनुमति नहीं है. सक्रियण राज्य विशेष LFA-1 एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो रहे हैं, इन एंटीबॉडी यहाँ उल्लिखित विधि के सापेक्ष कम संवेदनशीलता प्रदान करते हैं. वैकल्पिक तकनीकों पर मुख्य लाभ अपनी सादगी और एक साथ कई प्रयोगात्मक शर्तों की जांच करने की क्षमता है. एक विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए इस पद्धति पर विचार कर, एक टी कोशिकाओं नकारात्मक चयनित हौसले से अलग, और एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल किया जाना चाहिए कि ध्यान में रखना चाहिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
LFA-1 सक्रियण और टी सेल आसंजन से 12 संकेतों का अध्ययन करने के लिए कई assays कर रहे हैं. प्रवाह cytometry मुड़ा हुआ या LFA-1 बढ़ाया या तो चुनिंदा कि बाँध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग जीवित कोशिकाओं में LFA-1 आत्मीयता राज्…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil ट्रस्ट, माइकल Saperstein मेडिकल स्कॉलर्स रिसर्च फंड, और NYU व्हाइटहेड फेलोशिप इस काम का समर्थन किया.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
Referências
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