El uso de proteínas fluorescentes de Seguimiento glicosoma Dinámica en el tripanosoma africano

Summary

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Abstract

Trypanosoma brucei es un parásito kinetoplastid que causa tripanosomiasis humana africana (THA), o enfermedad del sueño, y una enfermedad degenerativa, nagana, en el ganado bovino ^1. Los suplentes de parásitos entre el torrente sanguíneo del huésped mamífero y el vector de la mosca tsetsé. La composición de muchos orgánulos celulares cambia en respuesta a las diferentes condiciones extracelulares ^2-5.

Glycosomes son los peroxisomas altamente especializados en los que muchas de las enzimas que intervienen en la glucólisis son compartimentados. Cambios en la composición glicosoma de una manera regulada en el desarrollo y el medio ambiente ^4-11. Actualmente, las técnicas más comunes que se utilizan para estudiar glicosoma dinámica es la microscopía electrónica y de fluorescencia; técnicas que son caros, tiempo y mano de obra intensiva, y no adaptarse fácilmente a los análisis de alto rendimiento.

Para superar estas limitaciones, un sistema indicador fluorescente en glicosomaque mejoró la proteína fluorescente amarilla (eYFP) se fusiona a una secuencia de peroxisomas focalización (PTS2), que dirige la proteína de fusión a glycosomes ^12, se ha establecido. Sobre la importación de la proteína de fusión PTS2eYFP, glycosomes vuelven fluorescentes. Orgánulos la degradación y los resultados de reciclaje en la pérdida de la fluorescencia que puede ser medido por citometría de flujo. Un gran número de células (5000 células / seg) se pueden analizar en tiempo real sin extensa preparación de la muestra tales como la fijación y el montaje. Este método ofrece una forma rápida de detectar cambios en la composición orgánulo en respuesta a las fluctuaciones de las condiciones ambientales.

Introduction

Trypanosoma brucei causa la enfermedad del sueño africana en los seres humanos y una enfermedad degenerativa, nagana, en el ganado bovino. Los fármacos utilizados en el tratamiento de estas enfermedades son anticuadas y extremadamente tóxico, las vacunas no están disponibles, y el potencial para el desarrollo de resistencia a los medicamentos requiere la búsqueda de nuevas dianas farmacológicas ^1.

Durante su ciclo de vida, T. brucei, se alterna entre un insecto vector y hospedador mamífero; dos hosts que se presentan muy diferentes entornos en los que el parásito tiene que sobrevivir. Una serie de cambios metabólicos y morfológicos se producen como el parásito está expuesto a diferentes condiciones ambientales. Algunos de los cambios más dramáticos se observan en parásitos microcuerpos específicos de una sola membrana limitada, denominada glycosomes ^13.

Los niveles de glucosa son relativamente altos (~ 5 mm) en el torrente sanguíneo y parásitos en el torrente sanguíneo (BSF) generan ATP exclusivamente a través de wh glucólisisile metabolismo mitocondrial es reprimida ^14. A diferencia de otros eucariotas en el que la glucólisis se produce en el citoplasma, T. brucei compartimenta mayoría de las enzimas glucolíticas en glycosomes ^14,15. Los parásitos son absorbidos por la mosca tsetsé durante una harina de sangre y experimentan una caída en la glucosa, que cae a niveles indetectables en los 15 minutos de ser ingerido por la mosca. El metabolismo de los insectos, la forma procíclica (PCF), parásitos es más flexible y glucosa, así como aminoácidos tales como prolina, se pueden utilizar en la síntesis de ATP ^16-18. Estudios proteómicos comparativos revelan cambios de ciclo de vida que dependen en glicosomal y proteínas mitocondriales con proteínas glucolíticos aumento en los parásitos del torrente sanguíneo y proteínas mitocondriales implicadas en el ciclo TCA y la cadena respiratoria ^13,19. Mientras que muchos estudios se han centrado en las diferencias entre BSF y glycosomes PCF, se sabe poco sobre los cambios en glycosomes PCF que se producen en respuesta a envcambios ironmental.

En el intestino grueso de la marcha, los niveles de glucosa son bajos con aumentos transitorios durante una alimentación ^20. En la mayoría de los estudios in vitro, los parásitos PCF se cultivan en medios que contienen glucosa. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los cambios del metabolismo PCF significativamente en respuesta a glucosa disponibilidad ^17. En ausencia de glucosa, la captación de prolina y prolina aumento de la actividad deshidrogenasa ^18. Este cambio en el metabolismo mitocondrial es probable que acompañado por un cambio en la composición y la morfología glicosoma, sin embargo, esto no ha sido evaluado directamente.

Electron y microscopía de fluorescencia se utilizan técnicas comunes para estudiar la dinámica glicosoma en T. brucei ^2,21-24. Estos protocolos son el tiempo y mano de obra intensiva, caro, y difícil de adaptar a los estudios en tiempo real y protocolos de alto rendimiento. Para superar esta limitación, un sistema indicador fluorescente u orgánulosed para estudiar orgánulos en los sistemas de mamíferos y levaduras se ha modificado para su uso en T. brucei ^12.

Sistemas de indicador fluorescente orgánulos se han utilizado ampliamente en eucariotas superiores tales como levadura, planta, y células de mamífero ^25-27. En tales sistemas, una proteína fluorescente se fusiona a una secuencia de aminoácidos que se dirige a la proteína a orgánulos específicos. La degradación o síntesis de las proteínas específicas se mide a través de la fluorescencia y los cambios en la composición del orgánulo se reflejan en cambios en la fluorescencia celular.

Cuando la fase de lectura abierta de la proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP) se fusiona con una secuencia focalización peroxisomal tipo II (PTS2) ^12, la proteína PTS2eYFP se importa a, glycosomes maduros-importación competente y de fluorescencia pueden ser monitoreados mediante citometría de flujo. Las variaciones en la composición glicosoma se reflejan en cambios en la fluorescencia celular. Este sistema puede ayudar a resolving los mecanismos que regulan los cambios inducidos por el medio ambiente en glicosoma composición.

Este manuscrito describe la generación de un sistema reportero glicosoma en los parásitos PCF en conjunción con la citometría de flujo para controlar la dinámica de glicosoma en tiempo real en parásitos vivos y proporciona un ejemplo de cómo se ha utilizado para seguir los cambios en glicosoma composición en respuesta a diferentes entornos. En resumen, glicosoma composición está influenciada por las concentraciones de glucosa extracelular y paso de cultivos en fase logarítmica en medio fresco provoca cambios en glicosoma composición. Este sistema puede ser modificado para estudiar el comportamiento dinámico de otros orgánulos en tripanosomas y otros parásitos.

Protocol

1. general Tripanosoma Ganadería Pesar sólidos para la preparación de medios SDM79 (Tabla 1). Almacenar a 4 ° C en 50 ml cónico o una bolsa Ziploc. NOTA: Los reactivos son estables durante al menos 6 meses. Descongelar el suero fetal bovino (FBS) en un baño de agua a 37 ° C, y mezclar periódicamente por inversión. NOTA: FBS se recibe del proveedor como una solución estéril. Filtro esterilización FBS reduce su capacidad para apoyar el crecimiento del parásito. …

Representative Results

En este sistema, se observó un cambio dependiente de la glucosa en glicosoma composición. Cuando las células se cultivan en medios que contienen glucosa, se observaron dos poblaciones; uno brillante y una tenue (Figura 2A). Células Dim albergan glycosomes inmaduras, que no han importado la PTS2eYFP mientras que las células brillantes albergan una mezcla de glycosomes maduros e inmaduros 12. Cuando la glucosa está presente en los medios de comunicación, mislocalization de glicosoma prot…

Discussion

Glycosomes son, orgánulos específicos del parásito esenciales y dinámicos. Los procesos que regulan la biogénesis, mantenimiento, proliferación y remodelación de estos orgánulos probable incluyen objetivos farmacológicos que podrían ser explotadas con fines terapéuticos. A pesar de la posibilidad de alta abundancia de tales objetivos farmacológicos, el campo de glicosoma biogénesis se ha quedado atrás el estudio de procesos similares en otros organismos, principalmente debido a la falta de un sistema de al…

Materials

Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium Chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium Chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50X)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100X)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium Biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-Streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A.Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation