Une nouvelle approche microdissection de la récupération<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Transcriptions spécifiques de formol paraffine fixe embarqué poumon granulomes
Summary
Microdissection a été largement utilisé pour l'examen de l'ADN, de l'ARN et de la protéine dans le tissu. microscopie de capture laser (LCM) est la méthode la plus couramment utilisée, mais une nouvelle technique de fraisage, mesodissection, est disponible depuis peu. Nous démontrons extraction d'ARN à partir mesodissected formol paraffine fixe des lames de tissus intégrés de granulomes de Mycobacterium tuberculosis.
Abstract
Microdissection a été utilisé pour l'examen des tissus à l'ADN, de l'ARN, et les taux de protéines plus d'une décennie. microscopie de capture laser (LCM) est une technique de microdissection le plus couramment utilisé aujourd'hui. Dans cette technique, on utilise un laser pour faire fondre focalement une membrane thermoplastique qui recouvre une coupe de tissu déshydratée 1. La coupe de tissu composite est alors soulevé et séparé de la membrane. Bien que cette technique peut être utilisée avec succès pour l'examen des tissus, il est long et coûteux. De plus, la réussite des procédures utilisant cette technique nécessite l'utilisation d'un laser, ce qui limite son utilisation. Une nouvelle approche de microdissection plus abordable et pratique appelée mesodissection est une solution possible pour les pièges de la LCM. Cette technique utilise le système à moulin MESO-1/MeSectr le tissu désiré à partir d'un échantillon de tissu monté coulissant tandis que simultanément la distribution et l'aspiration de fluide pour récupérer l'échantillon de tissu désiré enun peu de moulin consommable. Avant le début du processus de dissection, l'utilisateur aligne la formol paraffine fixe intégré (FFPE) glisser avec un hématoxyline et l'éosine souillé (H & E) lame de référence. Par la suite, l'opérateur annote la zone de dissection souhaitée et procède à disséquer le segment approprié. Le programme génère une image archivée de la dissection. Le principal avantage de mesodissection est la courte durée nécessaire pour disséquer une diapositive, en prenant une moyenne de dix minutes de mise en place pour déguster génération dans cette expérience. En outre, le système est considérablement plus économique et facile à utiliser. Un léger inconvénient est qu'il n'est pas aussi précise que la microscopie à capture laser. Dans cet article, nous montrons comment mesodissection peut être utilisé pour extraire l'ARN à partir de diapositives de granulomes FFPE causées par Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
Les échantillons ont été traditionnellement microdissection soit manuellement à partir d'un tissu ou lames à l'aide d'une aiguille et l'ensemble scalpel. Cela nécessite une séparation claire entre la section de tissu d'intérêt et les tissus environnants sections 2. Avec les progrès actuels de la technologie de profilage moléculaire, il a eu un besoin croissant d'évaluer les tissus au niveau cellulaire. En raison des limitations de microdissection manuel, y compris les techniques LCM ont été établis pour permettre une plus grande précision de l'isolement. Cette technique permet au chercheur d'isoler des populations de cellules spécifiques à partir de divers types de cellules et de diapositives, qui peuvent ensuite être utilisés pour des essais en aval comme profil d'expression génique. Bien que très efficace pour les essais en aval, LCM n'est pas sans limites. Tout d'abord, LCM est un processus long et coûteux. En outre, en raison de la nature instable de l'ARN, il est souvent difficile d'obtenir de l'ARN de haute qualité à partir de deux échantillons LCM. En raison de la disadvantages de LCM, de nouvelles avancées dans la technologie de microdissection sont encore nécessaires pour le rendre plus accessible à un plus grand nombre de chercheurs d'une manière sensible abordable et le temps.
Une telle avancée dans la technologie de microdissection maintenant disponible est une technique connue sous le nom mesodissection. Dans cette technique, on utilise une machine à l'usine de la section de tissu annotée d'intérêt et l'aspire dans un peu de moulin consommable 3. Ensuite, cet échantillon peut être aspiré dans un tube de collecte et utilisée pour des applications en aval. Les avantages de ce système est qu'il est beaucoup moins coûteuse en temps et sensible. Dans notre expérience, le système permet la dissection d'une section de tissu de granulome pulmonaire dans dix minutes. D'autre part, LCM traditionnel nécessiterait probablement heures pour terminer le processus. Le système permet à l'opérateur de charger une lame de référence à utiliser à titre de comparaison ainsi que l'outil pour l'annotation. En outre, un rapport est généré ème décrivantzone de e de la lame qui a été disséqué. Il existe deux principaux inconvénients de mesodissection. Bien qu'efficace à extraire des cellules multiples, il est difficile d'isoler une seule cellule. En outre, la précision de l'image générée n'est pas aussi clair que si vous utilisez d'autres microscopes d'imagerie.
La tuberculose (TB) est une cause majeure de décès des maladies infectieuses de l'humanité dans le monde entier et les résultats de l'infection par Mtb. Dans la majorité des personnes exposées à des aérosols de Vtt, l'infection est latente limitée. Dans au moins 10 millions de personnes par an, il en résulte la tuberculose active 4. Lors de l'infection latente, Vtt est contenu dans les lésions pulmonaires pathologiques appelés granulomes. Par conséquent, il a été avancé que le résultat de l'infection Vtt est décidé au niveau du granulome 5.
Ici, nous montrons comment mesodissection peut être utilisé pour microdissect granulomes provoqués par Mtb. Les diapositives utiliséessont des tissus pulmonaires FFPE de macaques rhésus infectés. Pour les besoins de cette démonstration, nous allons disséquer granulomes dans leur intégralité. Nous démontrons aussi que l'ARN peut être extrait à partir du tissu récupéré. Cette technique peut être appliquée à des échantillons de tissus à partir d'autres échantillons et ensuite utilisé pour une variété de dosages en aval.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection est une technique qui peut être appliquée à l'extraction d'ARN à partir de lames de lésions pathologiques provoquées par une grande variété de pathogènes. C'est une nécessité que l'utilisateur suit l'image et aligne l'image correctement. Pour ce faire, l'instrument doit être étalonné suivant les instructions sur le logiciel d'imagerie. Lors de la dissection, si la lame et de la zone d'intérêt étant disséqué ne correspondent pas, l'utilisateur doit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les NIH prix / sous-subventions suivantes pour le soutien de cette recherche: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, et P51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
Referências
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