A Novel Microdissection förhållningssätt till Återställa<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Särskilda Avskrifter från formalinfixerad paraffininbäddade Lung Granulom
Summary
Microdissection har i stor utsträckning använts för undersökning av DNA, RNA och protein i vävnader. Laser capture mikroskopi (LCM) är den vanligaste metoden, men en ny frästeknik, mesodissection är senast tillgängliga. Vi visar RNA-extraktion från mesodissected formalinfixerade paraffininbäddade vävnads diabilder av Mycobacterium granulom tuberkulos.
Abstract
Microdissection har använts för undersökning av vävnader på DNA, RNA och proteinnivåer i över ett decennium. Laser capture mikroskopi (LCM) är den vanligaste microdissection teknik som används idag. I denna teknik, är en laser används för att focally smälta en termoplast membran som ligger över en uttorkad vävnad avsnitt 1. Den vävnadssektion sammansatt lyfts sedan och separeras från membranet. Även om denna teknik kan användas med framgång för vävnads undersökning, är det tidskrävande och dyrt. Dessutom, det framgångsrika slutförandet av förfaranden som använder denna teknik kräver användning av en laser, vilket begränsar dess användning. En ny mer prisvärd och praktisk microdissection metod som kallas mesodissection är en möjlig lösning på de fallgropar av LCM. Denna teknik utnyttjar MESO-1/MeSectr systemet till kvarn önskad vävnad från en bild monterad vävnadsprov medan samtidigt dispensering och aspirera vätska för att återvinna den önskade vävnadsprovet ien förbruknings kvarn bit. Före dissektion processen börjar, justerar användaren formalin fasta paraffininbäddade (FFPE) glida med ett hematoxylin och eosin färgade (H & E) referens slide. Därefter annotates operatören det önskade dissektion område och fortsätter att dissekera det lämpliga segmentet. Programmet genererar en arkiverad bild av dissekering. Den huvudsakliga fördelen med mesodissection är den korta varaktigheten som behövs för att dissekera en slid, med ett genomsnitt av tio minuter från inrättat att sampla generationen i detta experiment. Dessutom är systemet avsevärt mer kostnadseffektiv och användarvänlig. En liten nackdel är att det inte är så noggrann som laser capture mikroskopi. I den här artikeln visar vi hur mesodissection kan användas för att extrahera RNA från diabilder från FFPE granulom orsakas av Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
Prover har traditionellt manuellt microdissected antingen hel vävnad eller bilder med hjälp av en nål och skalpell. Detta kräver en tydlig åtskillnad mellan vävnadssektionen av intresse och omgivande vävnader avsnitt 2. Med nuvarande framsteg inom molekylär profilering teknik, har det funnits ett ökande behov av att bedöma vävnad på cellnivå. På grund av de begränsningar av manuell microdissection, var tekniker inklusive LCM inrättats för att möjliggöra ökad isolering precision. Denna teknik gör det möjligt för forskare att isolera specifika cellpopulationer från olika cell-och objektglastyper, som sedan kan användas för efterföljande analyser såsom genuttryck profilering. Även mycket effektiv för efterföljande analyser, är LCM inte utan begränsningar. För det första är LCM en dyr och tidskrävande process. Dessutom, på grund av den instabila naturen hos RNA, är det ofta en utmaning att erhålla högkvalitativt RNA från LCM-proverna 2. På grund av den disadvantages av LCM, behövs fortfarande nya framsteg inom microdissection teknik för att göra det mer tillgängligt för ett större antal forskare i ett prisvärt och tidskänsliga sätt.
En sådan utveckling i microdissection teknik nu är en teknik som kallas mesodissection. I denna teknik en maskin används för att fräsa den kommenterade vävnadssnitt av intresse och suger den till en förbruknings kvarn bit 3. Därefter kan detta prov sugas in i ett provrör och används för tillämpningar efter. Fördelarna med detta system är att det är betydligt mindre kostsamt och tidskänsliga. Enligt vår erfarenhet, tillåter systemet dissektion av en lunga granulom vävnadssektion i tio minuter. Å andra sidan, skulle traditionell LCM sannolikt kräva timmar att slutföra processen. Systemet gör det möjligt för operatören att ladda en referens bildspel att använda som en jämförelse samt verktyg för anteckning. Dessutom en rapport genereras beskriver the område av bilden som dissekerades. Det finns två huvudsakliga nackdelar att mesodissection. Även effektiv vid extraktion av flera celler, är det svårt att isolera en enda cell. Dessutom är precisionen i bilden genereras inte lika tydligt som om du använder andra bild mikroskop.
Tuberkulos (tbc) är en viktig infektionssjukdom mördare av mänskligheten i världen och resultatet av infektion med Mtb. I en majoritet av individer som utsätts för aerosoler av Mtb, är infektionen latent begränsad. I åtminstone 10 miljoner människor per år, resulterar det i aktiv tuberkulos 4. Under latent infektion är Mtb finns inom patologiska lunglesioner kallas granulom. Därför har det hävdats att resultatet av Mtb infektion bestäms på samma nivå som den granulom 5.
Här visar vi hur mesodissection kan användas för att microdissect granulom orsakade av Mtb. Bilderna som användsär från FFPE lungvävnad från infekterade rhesusapamacaques. För denna demonstration kommer vi dissekera granulom i sin helhet. Vi visar också att RNA kan extraheras från den återvunna vävnaden. Denna teknik kan tillämpas på vävnadsprover från olika andra prover och sedan användas för en variation av efterföljande analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection är en teknik som kan tillämpas på RNA-extraktion från patologiska lesioner diabilder som orsakas av ett brett spektrum av patogener. Det är en nödvändighet att användaren spårar bilden och justerar bilden korrekt. För att åstadkomma detta måste instrumentet kalibreras efter anvisningarna på bildprogram. När dissekera, om bilden och intresseområde som dissekeras inte kan passas in, måste användaren kalibrera instrumentet. Ett annat kritiskt steg i dissekering processen är att ladda den ko…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för följande NIH utmärkelser / subawards för att stödja denna forskning: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, och P51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
Referências
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- . Mesodissection of fibrous tissue. AvanSciBio. , (2013).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
