Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar
Summary
Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir.
Abstract
GABAerjik inhibitör beyin nöronal devrelerin içinde merkezi bir rol oynarlar. Internöron nöronal bir topluluğun canlılığını (% 10-20) küçük bir alt kümesi ihtiva eder, ancak bunların çeşitli fonksiyonları yansıtan, fizyolojik morfolojik ve nörokimyasal heterojenlik yüksek bir seviyesini gösterir. Bu nedenle, internöronlar incelenmesi önemli organizasyon ilkeleri anlayışlar ve nöronal devrelerin fonksiyonu sağlar. Ancak bu durum, tek tek interneuron türlerinin seçimi ve tanımlanması için bir fizyolojik ve Nöroanatomik bir yaklaşım gerektirmektedir. Interneuron özel markörlerin promotörler altında floresan protein ifade eden transgenik hayvanların akut beyin kesitleri, kayıt, tam hücre patch-clamp, hedef ve elektrofizyolojik spesifik interneuron türleri iç ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için etkili bir yöntem sağlar. Hücre içi boya etiketleme ile birlikte, bu yaklaşım post-hoc mo ile uzatılabilirrphological ve immünositokimyasal analizi, kaydedilen nöronların sistematik bir şekilde tanımlanması sağlanır. Bu yöntemler kortikal nöronların çeşitli türdeki fonksiyonel özellikleri ile ilgili bilimsel sorular geniş bir yelpazede uygun hale getirilebilir.
Introduction
Hipokampal nöronal devreler nedeniyle uzun süredir insanlar ve kemirgenler hem onların öğrenme ve hafızada önemli bir rol yanı sıra mekansal navigasyon için anatomi ve fizyoloji, hem de saygı ile, yoğun inceleme konusu olmuştur. Aynı şekilde, hipokampusun önemli, ama basit laminar organizasyon bu bölge kortikal ağların yapısal ve fonksiyonel özelliklerini ele çalışmaların bir tercih konusu yapar.
Hipokampal devreleri uyarıcı asıl hücrelerin (>% 80) ve daha küçük (% 10-20), ancak inhibitör 1-3 derece çeşitli kohort oluşmaktadır. Internöron hızlı iyonotropik GABA A reseptörlerinin hareket akson terminallerinden γ-amino butirik asit (GABA) (GABA A Rs) ve yavaş metabotropik GABA B reseptörleri (GABA B TL) bırakın 4. Bu inhibisyon mekanizması uyarma dengelemek ve ana hücrelerinin uyarılabilirliğini düzenleyen ve böyleceir zamanlama ve deşarj desen. Bununla birlikte, GABA internöronlar salınan ana hücreler üzerinde değil, aynı zamanda kendilerini 5,6 internöronlar üzerinde de etki eder. Ön ve postsinaptik reseptörleri interneuron çeşitli türleri arasında geribildirim düzenleme ve inhibitör karşılıklı etkileşimlere aracılık. Interneuron ağlarda Bu önleyici mekanizmalar farklı frekanslarda 7'de özellikle sallantı- nesil ve nüfus aktivite desen şekillendirme, merkezi olduğuna inanılmaktadır.
Tüm hücre patch-kelepçe kayıt içsel özellikleri ve nöronların sinaptik etkileşimlerinin incelenmesi için köklü bir yöntemdir. Ancak, interneuron türleri yüksek çeşitlilik nedeniyle, inhibitör incelenmesi kaydedilen hücrelerinin titiz belirlenmesini gerektirir. Hipokampal interneuron türleri farklı morfolojik özellikler ve nörokimyasal işaretleyici ifade, kombine anatomik ve immünositokimyasal e nitelendirildiğindenxamination hassas interneuron kimlik 6,8,9 belirlemek için bir araç sağlayabilir.
Bu yazıda biz yavaş GABA B karakterizasyonu için izin, tek nöronların veya sinaptik-birleştiğinde çiftlerinden tüm hücre patch-kelepçe kayıtları post-hoc morfolojik ve immünositokimyasal analizi ile takip, hücre içi etiketleme ile kombine edildiği deneysel bir yaklaşım tanımlamak reseptör tespit internöronlarda inhibitör etkilere aracılık. Örnek olarak, biz onun postsinaptik hedeflerin soma ve proksimal dendritler innerve ve bir "fast çivilenmesi" (FS) ile karakterize edilir interneuron bir ana tip, sözde "basket hücrelerinde" (BC) bir alt kümesi, odaklanmak kalsiyum-bağlayıcı protein parvalbumin (PV), 10,11 desen yoğun hücre gövdesi kaplama tabakası bir akson ve ifade boşaltın. Bu internöron büyük postsinaptik inhibitör akımları, yanı sıra önde gelen pre gösterilecekGABAB R aktifleşmesinin 12 tepki olarak sinaptik çıkış sinaptik modülasyonu. Burada açıklanan tekniklerin kombinasyonu tanımlanmış diğer nöron türlerinden çeşitli intrinsik veya sinaptik mekanizmalarını incelemek için de eşit ölçüde uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz işlevsel in vitro morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan nöronlar karakterize etmek elektrofizyolojik ve Nöroanatomik tekniklerini birleştiren bir yöntem tarif; Özellikle kortikal inhibitör ins çeşitli türleri. Prosedürün önemli yönleri vardır: Potansiyel ins (1) ön seçim; (2) hücre içi kayıt ve nöron görselleştirme; ve nihayet (3) Kaydedilen INS morfolojik ve immünositokimyasal analizi. Bu çalışmada özellikle PV bileşenler ele olmasına rağmen, tarif edilen protokol minimal değ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar onu mükemmel teknik yardım için Ina Wolter teşekkür etmek istiyorum. VGAT Venüs transgenik fareler Dr ile oluşturulmuştur. Dr A. Miyawaki tarafından sağlanan pCS2-Venüs kullanarak Y. Yanagawa, M. Hirabayashi ve Milli Fizyolojik Bilimler Enstitüsü, Okazaki, Japonya Y. Kawaguchi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | – | – | see Uematsu et al., 2008 |
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | – | – |
| Dissection tools | i.e. FST | – | For brain removal |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | – | – | Custom-made in lab |
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | – | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | – | – | Custom made |
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | – | |
| Isolated constant voltage stimulator | Digitimer, Cambridge | DS-2A | – |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | – | – | Any high quality brand |
| Glass coverslips | – | – | Usually 22 x 22 mm |
| Agar spacers | – | – | Agar block, cut on vibratome to 300 μm |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | – | See Schindelin et al., 2012 |
Referências
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neurociência. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
