最適化された合成表面を使用した肝細胞表現型の安定化
Summary
この記事では、ヒト肝細胞を由来幹細胞の長期、安定的な培養のためにポリマーコーティングされた表面の開発に注力していきます。
Abstract
Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.
Introduction
生物学的材料は、広く、多能性幹細胞1の維持および分化に使用されている。可能にしながら、これらの生物学的基質は、多くの場合、未定義の構成要素の無数が含まれています。マトリゲルは、幹細胞の培養および分化のための一般的に使用される基板である。残念ながら、その可変組成は、細胞の機能および表現型に影響を与える。代替、複数の定義された生物学的マトリックスの多様2-7使用されてきたが、それらの動物由来または貧弱な拡張性は、彼らに工業的な製造には適さない候補にする。したがって、定義された組成と信頼できる性能を有する合成代替物の同定は、幹細胞研究の重要な目標である。
未定義の細胞培養基質の制限を克服する試みにおいて、化学と生物学との間の学際的コラボレーションは、細胞表現型をサポートする能力を有する合成材料を同定した。シンセエティックな基板は、スケーラブルであり、費用対効果、および複雑な3次元構造に製造することができ、 生体内環境を模倣する。によるこれらの特性に合成基質は、広く多くの細胞型8-10の分化を支持し、駆動するために使用されてきた。
Advancedおよびハイスループットアッセイは、大規模なライブラリーから、合成材料の迅速なスクリーニングを容易にし、生物医学の研究開発11-13の幅広いアプリケーションとの柔軟な特性を有する新規材料を提供してきました。高いスループットを利用して、高分子マイクロアレイスクリーニング技術は、急速にヒト幹細胞由来の肝細胞の維持に適した単純なポリウレタン（PU134）を同定した。このポリマーは、肝細胞の分化および機能14-16に関して動物由来の基質よりも優れていることが判明した。私たちは、その後の効果をアクセスするための塗布条件、地形や滅菌プロセスを最適化した肝細胞機能と寿命を安定化するポリマーの性能に。これは、セルベースのモデリングと再生医療アプリケーションのための肝細胞生物学の基礎を理解することに関して重要な意味を持っている。
ここで説明する技術は、合成ポリマーの表面が細胞表現型を維持するために最適化することができる方法の例を示している。私たちは、効率的な無血清肝細胞分化プロトコルでこの技術の組み合わせは、 インビトロモデリングや再生医療で使用するための肝細胞のスケーラブルな生産を提供する可能性を持っていることを信じています。
Protocol
Representative Results
Discussion
幹細胞から肝細胞を生成するために使用される現在の方法の多くは、動物由来の未定義のマトリックスに依存している。これらの基板は、アプリケーションに重大な障壁を表す、細胞の機能および安定性に影響を与える、費用がかかり、非常に可変であることができる。そこで、幹細胞由来肝細胞の培養を支持する合成材料のためのスクリーンを行った。私たちは、同定した、堅牢な肝細胞?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DCH、MBとFKは基金に関するEPSRCフォローによってサポートされていました。 BL-VとDSがそれぞれのMRC博士studentshipsによってサポートされていました。 KCは、英国再生医療プラットフォームからの資金によってサポートされていました。
Materials
| Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips | |||
| Shaker | Edmun Bühler | KS-15 | |
| Irradiator | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Scanning Electron Microscope | Philips | XL30CPSEM | |
| Atomic Force Microscope | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV bulb | ESCO | ||
| NanoScope analysis software | VEECO | version 1.20 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | TH45200 | Use Volocity 4 Software |
| Tissue culture plates | Corning, UK | 3527 | |
| glass slides | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| Diethylene glycol | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-hexanediol | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| Neopentyl glycol | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| Adipic acid | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| anhydrous N,N-Dimethylformamide | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| Diethyl ether | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| titanium (IV) butoxide | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butanediol | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| Vacuum oven | Thermoscientific | ||
| 4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofurane | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Store at room temperature |
| PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 |
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