הר הדמיה שטוחה של עור העכבר ויישומו לניתוח של שיער זקיק דפוסים וחושי אקסון מורפולוגיה
Summary
עור של יונקים מכיל מערך מגוון של מבנים – כמו זקיקי שיער וקצות עצבים – שמפגינים דפוסים ייחודיים של ארגון המרחבי. ניתוח עור כמו הר שטוח מנצל את הגיאומטריה 2 ממדית של רקמה זו להפקת תמונות ברזולוציה גבוהה בעובי מלא של מבני עור.
Abstract
עור הוא רקמה הטרוגנית מאוד. מבני התוך עורי כוללים זקיקי שיער, שרירי פילי arrector, התמחויות באפידרמיס (כגון צבירי תאי מרקל), בלוטות החלב, עצבים וקצות עצבים, ונימי דם. הסידור המרחבי של מבנים אלה נשלט בחוזקה בקנה מידה מיקרוסקופית – כפי שניתן לראות, למשל, בהסדר המסודר של סוגי תאים בתוך זקיק שערה אחת – ובקנה מידת מאקרוסקופי – כפי שניתן לראות על ידי האוריינטציות כמעט זהות של אלפי שיער זקיקים בתוך אזור מקומי של עור. לדמיין את המבנים האלה בלי חתך העור פיזי אפשרי בגלל הגיאומטריה 2 ממדית של איבר זה. בפרוטוקול זה, אנו מראים כי עור של עכבר יכול להיות גזור, קבוע, permeabilized, מוכתם, והבהיר כאובייקט שלם שני ממדים, הר שטוח. הפרוטוקול מאפשר להדמיה קלה של מבני עור בשלמותם דרך העובי המלא על שטחים גדולים של עור על ידי optחתך iCal ובנייה מחדש. תמונות של מבנים אלה יכולים גם להיות משולבים עם מידע על מיקום וכיוון יחסי לצירי הגוף.
Introduction
העור הוא אחד האיברים הגדולים ביותר בגוף, עם פונקציות חשובות בsomato-תחושה, בידוד / ויסות חום והגנה חיסונית 1. הבנת הבסיס המולקולרי ותאי של התפתחות עור ותפקוד כבר עניין ארוך שנים בגלל החשיבות הבסיסית של עור כמערכת ביולוגית ואת הרלוונטיות שלה לדרמטולוגיה. עור של יונקים מכיל מגוון של מבנים תאיים, כוללים שכבות מרובדת של קרטינוציטים, רקמת חיבור עורי, מספר סוגים של זקיקי שיער, בלוטות החלב, שרירי פילי arrector, כלי דם, ולפחות תריסר סוגים שונים של הביא (חושיים) ועצב efferent סיבים (איור 1). אזורים שונים בגוף הקשורים לסוגים שונים אופייני של עור. ברוב היונקים, כמעט על פני הגוף כולו מכוסה בעור, כי הוא ארוז בצפיפות עם זקיקי שיער. [בני אדם ועכברושי קרחים מהווים חריגים ההוא דפוס.] השיער חסר ממשטחי כף היד של כפות הידיים ורגליים, אשר קשור גם עם דפוסים מיוחדים אפידרמיס (dermatoglyphs), בלוטות אקסוקרינית, וקצות עצבים תחושתיים. אירועים התאיים ומולקולריים השולטים על הגדילה, התמיינות, וסידור המרחבי של תאים בתוך זקיק השיער הם עניין מיוחד כמו כל מוצגי זקיק, בזעיר אנפין, רבים מהתכונות של organogenesis 2 המרכזיות. תכונות אלה כוללות את קיומם של תאי גזע ונישת תאי גזע, הגירת תא כוריאוגרפיה מדויקת, והרכבה של מבנים תאיים מרכיבי embryologically מובחנים.
מאמר זה מתאר שיטות לביתור, תיקון, תיוג, ועור של עכבר ההדמיה כגיליון דו ממדים שלם, המכונים "הר שלם" או "שטוח הר" הכנה. מאז העור של עכבר הוא דק יחסית, ניתן לתמונה דרך העובי המלא של סקי שטוחn באמצעות מיקרוסקופיה confocal הקונבנציונלית. גישת ההר שטוחה להדמית עור של יונקים היא מבחינה טכנית יתרון משום שהוא עוקף את הצורך בחתך פיזי, ובכך לאפשר מבנים ששוחזרו לחלוטין על ידי חתך אופטי. מאחר שכמעט כולו עור מעובד כאובייקט יחיד, השטוח הר גישה גם מאפשרת ההדמיה של אזורים שונים על פני שטח הגוף תוך שמירת מידע על מיקום וכיוון יחסי לצירי הגוף. לבסוף, מבנים בתוך העור הם בדרך כלל נוכחים בדפוסים שחוזרים על עצמם במרווחים זמן קבועים, ובכך להקל על האוסף של תמונות מנציגים רבים של מבנה נתון. מאפיינים אלה הם מוכרים לneurobiologists שעובד על הרשתית, חלק שני ממדים של מערכת העצבים המרכזית, הנהנית מיתרונות דומים ללימודים של מורפולוגיה עצבית 3.
גישת הר השטוח המתוארת כאן היא של utilit המיוחדy ללימוד מבנים שמפגינים ארגון המרחבי בקנה מידה גדול יחסית בתוך המטוס דו ממדי של העור. דוגמא אחת לארגון המרחבי בקנה מידה גדולה היא הקוטביות מתואמת של זקיקי שיער ומבנים הקשורים לזקיק שיער – צבירי תאי מרקל, שרירי פילי arrector, בלוטות החלב, וקצות עצבים 4. זקיקי שיער הם בכיוון בזווית ביחס למישור של העור, והמרכיב של וקטור הזקיק שנמצאת בתוך המטוס 2 ממדים של העור, בדרך כלל מפגין התמצאות ביחס לצירי הגוף זה בדיוק נקבע לכל עמדה על הגוף. לדוגמא, זקיקי שיער על הנקודה חזרה ממקורי לזנב ושיער על פני השטח הגבי של כף הרגל מצביעים מפרוקסימלי לדיסטלי. הנטייה זקיק שיער נשלטת על ידי איתות קוטביות תא מישוריים (PCP; מכונית גם קוטביות רקמות 5). מערכת איתות זה התגלתה בדרוזופילה שבו קטןסט של גנים PCP ליבה נמצא כדי לשלוט בכיוון של שערות וזיפים cuticular. שלוש orthologues יונקים של גנים PCP ליבה – homolog המסולסל 6 (Fzd6, המכונה גם Fz6), cadherin EGF LAG הקולטן G-הסוג שבע העוקף 1 (Celsr1), וכמו Vang-2 (Vangl2) – ממלא תפקידים מקבילים ביונקים עור, תיאום האוריינטציות של זקיקי שיער עם צירי הגוף. מחקרים על עכברי נוקאאוט Fz6 (Fzd6 tm1Nat, להלן כFz6 – / -) מראה כי הפגם העיקרי בהעדר איתות PCP הוא אקראי או חוסר ארגון ראשוניים של אורינטצית זקיק שיער, ללא השפעה על המבנה הפנימי של הזקיקים 6-8. מערכת שאינו PCP שני פועלת מאוחר יותר כדי לקדם את היישור מקומי של זקיקים בקרבת מקום, מה שמוביל לייצור של דפוסי שיער בקנה מידה גדולה, כגון מערבולות וציציות.
דוגמא שנייה של בקנה מידה גדולהארגון המרחבי בתוך העור נראה במורפולוגיות של סוכות האקסון חושיות. יש עצב סנסורי המעצבב את עור גופי התא שלהם בשורש הגבי הגרעינים ומשולשים. נוירונים אלה לזהות טמפרטורה, כאב, גירוד, וסוגים שונים של עיוותים מכאניות הפוגעים בעור ובשיער 9. הם יכולים להיות מחולקים לתת מבוססים על קוטר האקסון ומהירות הולכה, מבנה קצה עצב מסוף, ואת דפוסי ביטוי של קולטנים, תעלות, ומולקולות אחרות. בגלל הצפיפות הגבוהה של עצבוב בתוך העור, ניתוחים המערבים לדמיין את כל האקסונים (למשל, immunostaining אנטי neurofilament) או אפילו את כל האקסונים של כיתה אחת (כפי שניתן לראות כאשר סוג תא בודד מתאפיין בביטוי של כתב ניאון) בדרך כלל מגלה סופרפוזיציה צפופה של אקסונים שעושה את זה בלתי אפשרי להגדיר את המורפולוגיה של סוכה בודדת. כדי לעקוף בעיה זו, השתמשנו l גנטי מכוון מאוד דלילabeling לייצר דגימות עור גב שבסוכות האקסון מבודדות היטב בודדות הם דמיינו ידי ביטוי של כתב histochemical, phosphatase אלקליין שליה האנושי 10. גישה זו מאפשרת להדמיה חד משמעית של מורפולוגיות סוכת האקסון אדם והגדרה של סוגי נוירון החושית על פי קריטריונים מורפולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שליטה בשיטות לנתיחה שתוארו לעיל דורשת רק סבלנות, יד יציבה, וכמה כלים לנתיחה טובים. נתיחת עור הגב היא קלה יחסית, אבל הזנב ועור כף רגל והניתוחים – בעיקר בגילים לאחר לידה מוקדמת – הם יותר מאתגר. בגילים מוקדמים לנשים בהריון (לדוגמא, לפני E15), העור קשה להסיר מבלי לקרוע אות…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
Referências
- Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. . Rook’s Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk, ., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
