Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Høy gjennomstrømming analysen til sin fenotype Published: August 11, 2014 doi: 10.3791/51759
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 2Department of Microbial and Molecular Pathogenesis, College of Medicine, Texas A&M University System Health Science Center, 3University of California, Irvine, 4Department of Medical Microbiology & Immunology, School of Medicine, University of California, Davis

Summary

En high-throughput analysen til in vitro fenotype Salmonella eller annen bakteriell forening, invasjon, og replikering i fagocyttiske celler med høy gjennomstrømming kapasitet ble utviklet. Metoden ble ansatt for å evaluere Salmonella genet knockout mutante stammer for sine engasjementer i verts-patogen interaksjoner.

Abstract

Salmonella arter er zoonotiske patogener og viktigste årsakene til matbårne sykdommer hos mennesker og husdyr 1. Forstå mekanismene bak Salmonella -host samhandling er viktig å belyse den molekylære patogenesen av Salmonella-infeksjon. Den Gentamicin beskyttelse analysen til fenotype Salmonella forening, invasjon og replikering i fagocyttiske celler ble tilpasset for å tillate høy gjennomstrømming screening for å definere rollene delesjonsmutanter av Salmonella enterica serotype Typhimurium i vert interaksjoner ved hjelp av RAW 264,7 murine makrofager. Under denne protokollen, variansen i målinger er betydelig redusert sammenlignet med standard protokollen, for villtype og mange mutant stammer kan bli testet i samme dyrkningsskål, og på samme tid. Bruken av flerkanalspipetter øker gjennomstrømningen og forbedrer presisjon. Videre bekymringer knyttet til å bruke mindre host celler per brønn i 96-brønners kultur fatet ble adressert. Her protokollen av den modifiserte in vitro Salmonella invasjon assay ved bruk av fagocytiske celler ble med hell anvendt for å fenotype 38 individuelle Salmonella delesjonsmutanter for krets, invasjon og intracellulær replikasjon. In vitro fenotyper er presentert, og noen av disse ble senere bekreftet å ha in vivo fenotyper i en dyremodell. Dermed blir endret, standardisert analysen fenotype Salmonella forening, invasjon og replikering i makrofager med høy gjennomstrømming kapasiteten kunne utnyttes mer generelt for å studere bakteriell-vert interaksjoner.

Introduction

Nontyphoidal Salmonella er viktige årsaker til enteriske sykdommer hos alle virveldyr. Salmonellose hos mennesker er blant de beste bakterielle matbårne sykdommer en. Karakterisering av de molekylære mekanismene som ligger til grunn interaksjoner av Salmonella med sine dyr verter oppnås hovedsakelig gjennom studiet av Salmonella enterica serotype Typhimurium (STM) i vev kultur og dyremodeller av infeksjon. Å få innsikt i STM-vert interaksjoner vil hjelpe oss å forstå hvordan Salmonella overleve og vokse inni vertsceller. Den første utfordringen i å studere disse interaksjonene er å identifisere så mange som deltar faktorer som mulig fra både vert og patogen, men disse bestrebelser er i stor grad hindret av betydelige vanskeligheter med å håndtere to uavhengige komplekse biologiske systemer samtidig, dvs. vert og Salmonella, under fysiologiske betingelser. I tillegg er det store repertoire av Salmonella og verts gener potensielt koder faktorer involvert i vert interaksjoner krever høy gjennomstrømming biologisk plattform for å takle denne utfordringen.

En modifisert, standardisert analysen til fenotype Salmonella forening, invasjon og replikering i makrofager med høy gjennomstrømming kapasitet ble utviklet for å undersøke et stort sett med gener sannsynlig engasjerende i Salmonella -host interaksjoner. Den Gentamicin beskyttelse analysen ble utviklet i 1973 2, men ble først grundig beskrevet av Elsinghorst i 1994 3,4. Det har nå blitt et standardverktøy for å studere mange intracellulære bakterier ex vivo, inkludert Salmonella 5,6. Internalisert bakterier unngå å bli drept av noen antibiotika, som Gentamicin, som ikke kan trenge eukaryote celler tre. Ved å utnytte dette fenomenet, måler Gentamicin beskyttelse analysen overlevelse og vekst av intracellulær bacterial patogener. Tre hendelser i løpet av infeksjon, dvs. tilknytning til eukaryote celler, invasjon og replikering, kan evalueres for intracellulære bakterier basert på tidsintervallet mellom infeksjon, Gentamicin behandling, og videre inkubasjon (figur 1). Eukaryote cellelinjer gir en fysiologisk miljø som er mindre kompleks enn relevante dyremodeller for host-patogen interaksjonsstudier.

Den Gentamicin beskyttelsesbestemmelse som er en egnet plattform for å studere STM-vert interaksjoner, men standard assay i en 24-brønns dyrkningsskål har lav gjennomstrømningskapasitet. Computational analyse av in vivo datasett identifisert 149 Salmonella genprodukter som er anslått til å samhandle med ca 300 verts genprodukter (upubliserte data). Standarden Gentamicin beskyttelsesbestemmelse som ikke har kapasitet til å fenotype dette antall mutanter effektivt.

I addition, kan Gentamicin beskyttelse analysen teoretisk oppdage invasjonen av enda en enkelt bakterie. På grunn av denne iboende følsomhet, rådata er utsatt for tekniske variasjoner når gjentatt på forskjellige tidspunkter. De interne kontroller og relative data presentasjon etter normalisering er avgjørende for meningsfull tolkning av resultatene. Gitt disse betraktninger, ble en modifisert, standardisert Gentamicin beskyttelse assay utviklet for å teste kapasitet og øke presisjon.

Den følgende protokoll er beskrevet og illustrert for å utføre den modifiserte Gentamicin beskyttelsesbestemmelse ved hjelp av 96-brønners kultur-retter og murin makrofag RAW264.7 cellelinje. Sammenlignet med standard protokollen i 24-brønners dyrkingsskåler, har modifisert protokoll de følgende fordeler: 1) Ved bruk av 96-brønners kultur retter tillater opp til 10 forskjellige mutantstammer som skal phenotyped inkludert interne positive og negative kontroller med tilstrekkelig statistisk styrke;2) Variansen resultater er betydelig redusert, fordi de mutantstammer blir testet på samme dyrkningsskål, og på samme tid; 3) Bruk av flerkanalspipetter øker gjennomstrømningen og reduserer tretthet. Til slutt sammenligner til 24-brønns dyrkingsskåler, ble bekymringene mindre verts celler per brønn i 96-brønners dyrkningsskål adressert gjennom protokoll optimalisering og standardisering.

I sammendraget, den modifiserte, standardisert analysen til in vitro fenotype Salmonella eller annen bakteriell forening, invasjon og replikering i fagocyttiske celler øker presisjon og oppnår høy gjennomstrømming kapasitet og reduserer tretthet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Murine Macrophage RAW264.7 Cell Culture

  1. Dyrk lav passasje tall murine makrofager, RAW264.7 (The ATCC ® Antall, TIB-71) i en T-75 cellekulturkolbe ventilert filterlokket i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) , 0,5% NaHCO3 og 1% 100 x ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) ved 37 ° C, i en 5% CO2 inkubator.
  2. Når cellene når en 60-80% sammenløp i kolben, bruke en celleskrape for å høste cellene og tell cellene i et hemacytometer og beregne cellekonsentrasjonen.
  3. Resuspender cellene og fortynn cellekonsentrasjonen til 2,5 x 10 5 / ml i frisk DMEM cellekulturmedium. Bruk flerkanalspipetter til platen 200 ul DMEM cellekulturmedium inneholdende 5 x 10 4 celler i hver brønn av 96-brønners cellekulturplater.
  4. Plate fire brønner i hver Salmonella belastning. Satt opp tre separate plater for ett settav phagocytic celler invasjon analysen, og merk dem med "foreningen", "invasjon" og "replikering", henholdsvis.
  5. Plasser platene i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C på slik at makrofager til å feste til bunnen av brønnene.

2. Fremstilling av Salmonella Wild-type og mutanter

  1. På samme dag med å forberede de makrofag RAW264.7 celler, plukke enkeltkolonier av villtype (WT) Salmonella enterica serotype typhimurium 14028s, DinvA mutant, DphoP mutant, og de ​​ønskede test mutantstammer, og kultur dem i Luria-Bertani ( LB) kjøttkraft supplert med antibiotika som passer. Bruk hvert sett av phagocytic celler invasjons analyser for å teste opp til 10 mutante stammer (DinvA mutant og DphoP mutant er defekte i invasjonen og intracellulær replikering, henholdsvis).
  2. Dyrke bakteriene i 14 timer ved 37 ° C med shaking ved 220 rpm i 5 ml hver av LB-næringsløsning i løst avkortet 14 ml polypropylen i et rundbunnet rør. LB-næringsløsning inneholder egnede antibiotika, i vårt tilfelle, de fleste av mutantstammer er resistente overfor kanamycin, 50 pg / ml
  3. Den neste dagen, subkultur hver av de ON kulturer av Salmonella-stammer i vanlig 5 ml LB-buljong ved et forhold på 01:50 i ytterligere 4 timer med risting ved 220 rpm.
  4. Les OD 600 verdier for hver bakteriekultur på et spektrofotometer, og hver lese bør ligge 0,6 til 1,2 for å optimalisere Salmonella patogenitet island-1 type III sekresjon system (SPI-en TTSS) genuttrykk for invasjonen.
  5. Bruk av formel 1 OD 600 = 7,5 x 10 8 CFU / ml for å estimere bakteriell konsentrasjon, deretter fortynnes bakteriene til en konsentrasjon på 5 x 10 6 CFU / ml i frisk DMEM cellekulturmedium.

3. Invasion analysen i 96-brønners kultur plate

  1. Fjern tre 96-brønners cell kultur plater fra CO 2 inkubator og vask hver brønn en gang med 200 mL av 1x PBS buffer.
  2. Etter vasking og fullstendig fjerning av PBS, tilsett 200 ul bakterier i DMEM medium (se ovenfor) i hver brønn. Dette resulterer i en 6 x 10 Salmonella-celler i hver brønn, og multiplisitet av infeksjon (MOI) på 20: 1..
  3. Sentrifuger platene ved 1000 xg i en lukket transportør for 10 min, deretter erstatte platene (tid null) i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator i 30 min. For hver stamme, sette opp minst fire duplikate brønner.
  4. Etter 30 min fjerne platene fra inkubatoren og vaskes tre ganger med 200 ul av 1 x PBS for å fjerne ikke er tilknyttet, bakterier.
  5. Etter vasking, lagre platen er merket med "foreningen" for videre behandling. Tilsett 200 ul DMEM medium inneholdende 100 pg / ml Gentamicin til hver brønn av platene som er merket med "invasjon" og "replikasjon" for to drepe det ekstracellulære Salmonella. Returner platene til 37 ° C, 5% CO2 inkubator i en ytterligere time.
  6. Lagre en brønn fra hver infiserte stamme for opptak av makrofag celletelling, behandler resten av brønner på "assosiasjon" plate med 200 ul av 1 x PBS inneholdende 1% Triton X-100 i 10 min. Triton løsningen vil lysere makrofager og utgivelsen forbundet Salmonella.
  7. Innhøsting Salmonella fra hver brønn og plassere dem i 1,5 ml Eppendorf-rør. Utfør tre 10 fold seriefortynning med 900fxl 1x PBS på høstet prøver fra hver brønn, er vortex utføres mellom hver fortynning.
  8. Plate tredje fortynning, 10 -3, på enten LB (WT) eller LB Kan (mutanter) plater. Merke platene med passende Salmonella belastning navn, fortynning nummer, tidspunkt og dato.
  9. Etter virvling den tredje fortynning røret, fordeles 10 ul prøve på overflaten av agaren og gjenta fvåre ganger for totalt 5 dråper. Sørg for å plass til fem 10 mL faller jevnt på petriskål plater 7.
  10. Etter at dråpene suge inn i agaren, snu platene over og inkuberes over natten ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
  11. Behandle brønner som er lagret for telling av makrofager med 150 mL 1XPBS inneholdende 0,25% Trypsin-EDTA i 10 min.
  12. Etter trypsinization, sted makrofager i 1,5 ml Eppendorf-rør og behandle dem med 50 pl FBS å nøytralisere Trypsin / EDTA løsning, beis cellene med 0,4% Trypanblå og scorer dem gjennom å bruke hemacytometer.
  13. Når én time inkubasjon er gått, fjerne "invasjon" og "replikering" platene fra CO 2 inkubator, og vaske hver brønn som "Steg 3.4".
  14. Lagre "invasjon" plate for videre behandling som "Step 03.06-03.12".
  15. Tilsett 200 ul DMEM medium inneholdende 10 ug / ml Gentamicin tilden "replikering" plate for å opprettholde klaring av ekstracellulært Salmonella i mediet. Returner platen til 37 ° C, 5% CO2 inkubator i ytterligere 22.5 timer.
  16. Den neste dagen, fjerne "replikering" plate fra 37 ° C, 5% CO 2 inkubator, og vaske hver brønn som "Step 3.4" og behandle dem som "Trinn 03.06-03.12".
  17. Til slutt, fjerne agarskålene etter inkubering over natten i 37 ° C inkubator og score mange bakteriekolonier.
  18. En god koloni fordeling bør være mellom 10 og 100 kolonier, ca inneholder hver flekk 2 til 20 kolonier, ville det være vanskelig å plassere ballen hvis det var mer enn 20 kolonier på ett sted. Hvis antallet er for lav eller for høy, replate prøven med 10 ganger høyere eller lavere fortynninger etter behov.

4. Data Analysis

  1. Beregn CFU (kolonidannende enheter per ml) av hver plate, basert på plettervolum og fortynningsfaktoren.
  2. Fastslå antall Salmonella per makrofag gjennom det innspilte makrofag celletall fra hver stamme.
  3. Beregn de geometriske middel for CFU per makrofag fra minst tre uavhengige eksperimenter for cellekrets, invasjon eller replikasjon, henholdsvis, og normaliseres videre til WT til den relative verdien.
  4. Analysere dataene for foreningen, invasjon, og replikering av Student t-test henholdsvis ved å sammenligne hver stamme til WT, og bestemme statistisk signifikans ved p-verdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Se representative resultater (figur 2) etter at data er plottet basert på den modifiserte fagocytisk celle invasjon assay. Dataene omfatter fem ulike stammer, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A, og mutant B. Δ Inva, kjent for å være defekt for invasjonen, og ΔphoP kjent for å være defekt for replikering 8, blir brukt som positive kontroller for å vurdere den eksperimentelle validiteten . Faktisk, i den modifiserte invasjonen analysen, er en ΔinvA mutant internalisert dårlig av RAW264.7 celler og en ΔphoP mutant hadde redusert replikasjon etter 24 timer. Mutants A og B er representative stammer analysert ved hjelp av denne protokollen. Mutant A viser signifikant reduksjon av replikering (figur 2), ligner på en ΔphoP mutant; Interessant nok viser mutant B en betydelig økning i replikasjon (figur 2). De data klart indikerer begge disse mutaNTS har endret fenotyper for invasjon og overlevelse i makrofager.

I sammendraget, ble mange Salmonella delesjonsmutanter individuelt phenotyped for engasjement i bakteriell forening, invasjon, og replikering i RAW264.7 makrofager bruker den modifiserte invasjonen analysen. Tjue av 38 testede mutanter så langt vist variable, men betydningsfulle defekter i bakteriell infeksjon av makrofager (tabell 1), dermed endret analysen til in vitro fenotype Salmonella eller annen bakteriell forening, invasjon og replikering i fagocyttiske celler øker presisjon og høy gjennomstrømming kapasitet mens reduserer tretthet.

Figur 1
Figur 1. Arbeids ordningen med høy gjennomstrømming analysen. Gentamicin beskyttelse analysen er modifisert, standardisert til fenotype mange Salmonella mutanter samtidig i 96-brønners plater. De viktigste trinnene er utført som ovenfor for å undersøke forening, invasjon og replikering av Salmonella i RAW264.7 makrofager.

Figur 2
. Figur 2. Representative resultater De high-throughput analyser er utført for Salmonella stammer - WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A og mutant B - i RAW264.7 makrofager. For hver stamme, er de geometriske middel for CFU per makrofag erholdt fra tre uavhengige eksperimenter for cellekrets, invasjon og replikasjon, henholdsvis, som er ytterligere normalisert til WT og grafisk representasjon er vist. Feilfelt betegne standardfeilen, og statistisk signifikans av hver stamme referertetil WT ble bestemt av Student t-test. * P <0,05. MOI = 20.

Tabell 1
Tabell 1. Fenotyper av kandidatgener. Kandidat Salmonella mutanter er phenotyped av den modifiserte, standardisert test for foreningen, invasjon og replikering i RAW264.7 makrofager. 20 mutanter har betydelige mangler i foreningen, invasjon og / eller replikering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den Gentamicin beskyttelsesbestemmelse som er mye brukt for å studere den invasjon og replikasjon av intracellulære bakterielle patogener inne vertscellen, og det er spesielt et viktig verktøy for å studere biologiske patogener, slik som Salmonella, hvis invasjonen er forutsetningen skritt for å etablere en infeksjon. Standarden Gentamicin beskyttelse analysen i Salmonella forskningsmiljøet er implementert i 24-brønns kultur fatet fem. Selv om bruken av 48 eller selv 96-brønners plater ble diskutert tidligere for høy gjennomstrømningskapasitet 9, har ingen faktiske protokollen er vist i detalj, og med hell anvendt for å teste en samling av bakterielle mutanter. Her fremstilles et modifisert og standardisert protokoll ble utviklet for å bruke 96-brønners kultur retter til fenotype Salmonella-mutanter. Spesielt, denne protokollen ble kun testet for Salmonella og fagocytiske celler, og dermed modifikasjoner og optimalisering ville åpenbart være nødvendig med othe r bakterier eller vertsceller.

Det er flere fordeler til endret Gentamicin beskyttelse analysen til fenotype Salmonella forening, invasjon og replikering i fagocytiske celler. For det første tillater den 96-brønns dyrkningsskål format high-throughput testing og analyse, opp til 10 forskjellige stammer kan testes samtidig med tilstrekkelig gjentagelse statistisk analyse og interne kontroll. For det andre, på grunn av den høye følsomheten til analysen, kan de rå data av Gentamicin beskyttelsesbestemmelse være utsatt for tekniske variasjoner når gjentatt på forskjellige tidspunkter. Under dette modifisert protokoll, blir flere stammer phenotyped under de samme betingelser gjennom hele prosessen, noe som reduserer avviket. Til slutt, bruk av flerkanalspipetter øker effektiviteten og reduserer tretthet. Den nye protokollen tilrettelagt den raske Fenotyping mange Salmonella mutanter mens generere store mengder kvantitative, reproduserbare data.

ove_content "> En bekymring i å gjøre invasjon analyser i 96-brønners kultur retter er at brønnene inneholder færre eukaryote celler, og på grunn av dette kvantifisering kan være kompromittert. For å møte denne bekymringen, ble en stor serie med analyser utført for å optimalisere reproduserbarhet. Først , de RAW264.7 makrofager som brukes i denne protokoll hadde færre enn 20 passeringer, og cellene ble utsådd på en 96-brønners dyrkningsskål over natten før analysen andre, MOI ble redusert til 20:. fra en regelmessig brukt 50: 1 eller 100: 1 A MOI 20:.. 1 sørger for at 99% av makrofager vil bli utsatt for infeksjon av 10 til 30 bakterier beregnet av Poisson-fordeling i henhold til den stokastiske punktet Det er antatt at, ikke er begrenset til biologiske faktorer, celleskade kan være . forårsaket fra overveldende bakterier fysiske kontakter 10 I tillegg kan Salmonella invasjon indusere apoptose av makrofager, noe som er positivt forbundet med høy MOI 11 Bruke en MOI på 20:. 1, cellular DAMAGe ble funnet å være minimalt, antagelig på grunn av begrenset bakterie macrophage fysisk kontakt. For det tredje, inkubasjonstiden tidsintervall ble optimalisert for de tre tidspunkter: krets i 30 min med ingen Gentamicin; invasjon for ytterligere 1 time (totalt 1,5 timer post-infeksjon) med 100 pg / ml gentamicin; replikering for ytterligere 22.5 timer (totalt 24 timer etter infeksjon) med 10 mikrogram / ml gentamicin. I vår test, er 5 ug / ml Gentamicin tilstrekkelig til å drepe alle de Salmonella i cellefrie DMEM med 10% fetalt bovint serum (upubliserte data), og dermed, 100 pg / ml Gentamicin ville være forventet å sikre rask dreping og 10 g / ml Gentamicin ville opprettholde klaring av ekstracellulære bakterier i cellekulturmedium for inkubering over natten In vivo, det tar omtrent 15 min for å påvise Salmonella vev assosiert med kalv tarm epitelceller 12,13;. in vitro, er 30 min inkubasjon rapportert være tilstrekkelig for villtype 14. For standard invasjonen analysen, er arbeidsmengden i de to første tidspunkter ganske intense på grunn av vasking, seriell fortynning og platekledning. Den nøyaktige tidsintervall for hvert tidspunkt ble oppnådd ved å utnytte flerkanals pipetter, fordi enheten i betydelig grad øker operatørens effektivitet og presisjon. Videre ble prøven pletteringsteknikk etter å ha endret seriell fortynning, i stedet for plating 100 pl og manuelt sprer, 5 separate dråper av 10 ul ble platet ut for hver gjentakelse brønn på platene, som i stor grad reduserer pletteringstiden og øker nøyaktigheten, fordi den endelige telle per brønn er scoret fra fem belagt prøver. Sammen er disse optimalisering og standardiseringsarbeid, øke reproduserbarheten til analysen, kan ulike operatører gjentatte ganger oppnå konsistente resultater til ulike tider.

Denne protokoll benytter fagocytiske celler i stedet for epitelceller for denne analyseni en mindre 96-brønns format. I studere patogenesen av salmonellose, er den mest brukte epitelial cellelinjen Caco-2, avledet fra heterogent human epitelial kolorektal adenokarsinom. Ved hjelp av den vanlige 24-brønns dyrkningsskål invasjon test med Caco-2-celler, det faktiske antall bakterier gjenvunnet ved hvert tidspunkt, spesielt 22,5 timers tidspunktet for Fenotyping replikasjon, er mye lavere enn når fagocytiske celler, slik som J774 eller RAW264 0,7 makrofager, blir brukt (upubliserte data). Således, og dette gjør det mer vanskelig å utføre Fenotyping ved hjelp av en 96-brønns dyrkningsskål når hver brønn har færre vertsceller. Det er kjent at makrofager celler kunne aktivt uskadeliggjøre bakterier, som kan føre til at flere bakterier blir internalisert, og det kan heller ikke utelukkes at Salmonella tilsynelatende replikere saktere i Caco-2 celler. Evnen til Salmonella til å overleve og replikere inne i makrofager er relatert til viktige roller i patogenesen avsalmonellose, dvs. utløser massive vert betennelsesresponser og tilrettelegging systemisk infeksjon 1. Vi hovedsakelig ansatt den modifiserte og standardisert Gentamicin beskyttelse analysen til fenotype et stort sett med beregning rørlednings utvalgte gener for deres potensielle engasjementer i vert interaksjoner. Det viste seg nesten 50% av Salmonella-mutanter ble phenotyped som gener som er involvert i intracellulær replikasjon i fagocyttiske celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble delvis støttet av et stipend for National Institutes of Health NIAID (for AJB og LGA, R01 AI076246). Salmonella mutant samlingen ble delvis støttet av National Institutes of Health tilskudd (for MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 og R01 AI075093-01), dels ved National Institutes of Health tilskudd (for HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Vi takker Steffen Prowollik for replika plating og bekrefter mutantene i samlingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11965
Fetal bovine serum HyClone SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap Nest Biotechnology 708003
100x Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140
Cell scraper BD Falcon 353086
96-well Cell culture plate Corning Incorporated 3595
Luria-Bertani (LB) broth MP Biomedicals 3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube BD Falcon 352059
PBS pH 7.4 (1x) Life Technologies 10010
Triton X-100 Sigma T-8787
Kanamycin solution Sigma K0254
Gentamicin solution Sigma G1272
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200
Trypan blue Sigma T8154

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
  2. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
  3. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
  4. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
  5. Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
  6. Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
  7. Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
  8. Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
  9. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
  10. Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
  11. Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
  12. Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
  13. Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
  14. Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).

Tags

Smittsomme sykdommer , forening invasjon replikering fenotype intracellulære patogener makrofager
Høy gjennomstrømming analysen til sin fenotype<em&gt; Salmonella ente</em&gt; Typhimurium Association, Invasion, og Replication i makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, J., Pugh, R., Laughlin, R. C.,… More

Wu, J., Pugh, R., Laughlin, R. C., Andrews-Polymenis, H., McClelland, M., Bäumler, A. J., Adams, L. G. High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages. J. Vis. Exp. (90), e51759, doi:10.3791/51759 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter