Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie
Summary
This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.
Abstract
Einzelmolekül-Mikroskopie ist als ein leistungsfähiges Konzept, um das Verhalten von Signalmolekülen, insbesondere in Bezug auf jene Aspekte (zB., Kinetik, Koexistenz der verschiedenen Staaten und Bevölkerungen, transiente Wechselwirkungen), die in der Regel in Ensemblemessungen versteckt sind, wie die sich abzeichnen die mit biochemischen Standard oder Mikroskopieverfahren erhalten. So, dynamische Ereignisse, wie Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen, kann in Echtzeit in einem lebenden Zelle mit hoher raum-zeitlichen Auflösung verfolgt werden. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die auf der Markierung mit kleinen und hellen organischen Fluorophore und totale interne Reflexion (TIRF) Mikroskopie einzelner Rezeptoren auf der Oberfläche von lebenden Zellen direkt sichtbar zu machen. Dieser Ansatz erlaubt es, genau zu lokalisieren Rezeptoren, messen Sie die Größe der Rezeptor-Komplexe, und erfassen dynamische Vorgänge, wie transient receptor-Rezeptor-Wechselwirkungen. Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung, wie perform eine Einzelmolekül-Experiments, einschließlich Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Bildanalyse. Als ein Beispiel der Anwendung dieses Verfahrens auf zwei G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu analysieren, dh., Β 2-adrenergen und γ-Aminobuttersäure Typ B (GABA)-Rezeptor berichtet. Das Protokoll kann auch für andere Membranproteine und verschiedene Zellmodelle, Transfektionsmethoden und Markierungsstrategien anpassen.
Introduction
Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu erfassen und die extrazelluläre Umgebung reagieren auf eine Vielzahl von Stimuli, wie z. B. Duftstoffe, Ionen, Neurotransmittern kleinen und großen Proteinhormone. Die Flüssigkeit Natur der zellulären Membranen ermöglicht Bewegungen von Rezeptoren und anderen Membranproteinen. Dies ist wichtig für die Bildung von Proteinkomplexen und dem Auftreten von transienten Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie sie von Rezeptoren verwendet werden, um in Funktionseinheiten zusammenzubauen und zu transduzieren Signale ins Zellinnere. Zum Beispiel G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die die größte Familie von Zelloberflächenrezeptoren 1 ausmachen, sind vorgeschlagen worden, um di-/oligomers, die in der Feinabstimmung Regulierung der Signaltransduktion beteiligt zu sein scheint und bilden könnte wichtige physiologische und pharmakologische Auswirkungen haben 2-5.
Einzelmolekül-Mikroskopie hat das große Potential der Visualisierung direkt mit hoher spatiotempMund Auflösung das dynamische Verhalten der einzelnen Rezeptoren auf der Oberfläche von lebenden Zellen, einschließlich ihrer Verbindung angeordnet ist, um Dimere und höhere Ordnung Molekülkomplexe 6-10 bilden. Dies bietet mehrere Vorteile gegenüber Standard biochemischen und Mikroskopieverfahren, die in der Regel den Durchschnittswert Verhalten von Tausenden oder Millionen von Molekülen.
Proteinmarkierung mit einem ausreichend hell und photo Fluorophor für Einzelmolekül-Mikroskopie von wesentlicher Bedeutung. Dieses Protokoll nutzt die kürzlich eingeführten SNAP-Tag 11 bis kovalent klein und hell organischen Fluorophore Zelloberflächenrezeptoren. SNAP ist ein 20 kD Protein-Tag aus der menschlichen DNA-Reparaturenzym O 6-Alkylguanin-DNA Alkyltransferase, die irreversibel mit fluorophorkonjugierten Benzylguanin (Fluorophor-BG)-Derivate bezeichnet werden kann, abgeleitet. CLIP, eine weitere technisch-Tag aus SNAP abgeleitet, kann stattdessen mit Fluorophor-c gekennzeichnet werdenonjugated benzylcytosine Derivate 12.
Das Protokoll in diesem Manuskript berichtet, erklärt, wie Transfektion und Label-SNAP-11-Rezeptoren getaggt mit kleinen organischen Farbstoffen und benutzen Totalreflexion (TIRF) Mikroskopie einzelne Rezeptoren oder Rezeptor-Komplexe auf der Oberfläche lebender Zellen 10 visualisieren. Die berichteten Ergebnisse im Protokoll> 90% Markierungseffizienz eines extrazellulär SNAP-markierten Zelloberflächenprotein 10. Weitere Informationen darüber, wie Einzelmolekül-Daten verwenden, um die Größe und die Mobilität von Rezeptor-Komplexe zu analysieren, als auch transient receptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu erfassen, bereitgestellt. Eine schematische Ablauf des gesamten Protokolls ist in Fig. 1 angegeben. Als Beispiel die Transfektion von Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen, die mit SNAP-markierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) durch Markierung mit einem Fluorophor-BG-Derivat wie folgt sowie ihre Anwendung auf quantify und Monitor-Rezeptor di-/oligomerization beschrieben. Dieses Protokoll kann auch für andere Zelloberflächenproteine und fluoreszierende Markierungen (zB., CLIP), sowie zu anderen Transfektions-und Markierungsverfahren erweitert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebenen Protokoll ermöglicht die Analyse der räumlichen Anordnung, Mobilität und Größe der Zelloberflächenrezeptor-Komplexen auf Einzelmolekülebene. Verglichen mit der Verwendung von fluoreszierenden Proteinen, Markierung mit kleinen organischen Fluorophoren, die heller und photostabil sind, hat den Vorteil, daß die erweiterte Darstellung der einzelnen Rezeptor Teilchen. Da sehr niedrige Expressionsniveaus erzielt werden (<0,45 Rezeptor Teilchen / &mgr; m 2), die Eigenschaften der Rez…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plare | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin – streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
Referências
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