Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen
Summary
Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.
Abstract
Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.
Introduction
Lymfeklieren zijn gespecialiseerde compartimenten waar adaptieve immuunrespons tegen buitenlandse en zelf-antigenen worden geïnitieerd en gecoördineerd. De hier gepresenteerde betreft hier een korte enzymatische digestie gecombineerd met geautomatiseerde mechanische pipetteren om lymfeklier enkele celsuspensie te verkrijgen en toegang tot levensvatbare lymfeknoop stromale cellen die de oppervlakte-expressie van verscheidene moleculen kunnen onderhouden.
Lymfeklier stromale cellen vormen het skelet van de lymfeklieren en aan drie belangrijke functies: ten eerste ze filteren lichaamsvloeistoffen antigenen, pathogenen en hun pathogeen geassocieerde moleculaire patroon (PAMPs), alsook cytokines en gevaar geassocieerde moleculaire patroonvoorbeeld (DAMPs) aanwezig in het lichaam. Ten tweede, ze trekken en instrueren antigen presenterende cellen (APC) en lymfocyten te werken en initiëren adaptieve immuunreacties; en derde zij structureel omgeving voor de homeostase en differentiatie van lymfocyten 1-3. Tijdens ontsteking lymfeknoop stromale cellen groeifactoren, cytokines en chemokines, passen zwelling daardoor organiseren de interactie tussen dendritische cellen (DCs), T-en B-cellen. De orkestratie van immuunresponsen alleen mogelijk door de complexe structurele architectuur opgebouwd uit verschillende stromale cel populaties.
Lymfeklier stromale cellen zijn CD45 negatieve cellen en kan worden onderscheiden door de expressie van CD31 of GP38 in fibroblastische en endotheelcellen 1 -6. Gp38 + CD31 – T zone definieert reticulaire cellen (TRC, ook bekend als FRC: fibroblast reticulaire cellen), gp38 + CD31 + definieert lymfatische endotheelcellen (LEC), gp38 – CD31 + definieert bloed endotheelcellen (BEC). Verdere karakterisering van de subpopulaties onthulde het bestaan van andere lymfeknoop stromacellen. Er werd een kleine pericyte-achtige celpopulatie kenmerk in degp38 – CD31 – bevolking 7. Derhalve aanpassing van de isolatie moet voordelig voor identificatie en karakterisatie van de functionele eigenschappen van verschillende lymfeknoop stromacellen.
Vóór de ontwikkeling van lymfeknoop stromacellen digestie protocollen de studie van lymfeknoop stromacellen beperkt tot in situ metingen waarbij weefselsectie en microscopie. Niettemin structurele en functionele studies toonden belangrijke kenmerken van lymfeknoop stromale cellen. Lymfeknoop stromale cellen geassocieerd met podoplanin, collageen en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten een complex 3 dimensionale structuur genoemd leidingsysteem, dat lymfe en bijbehorende laag molecuulgewicht eiwitten vervoert van de subcapsulaire sinus van de lymfeklieren van de hoge endotheliale vormen venulen in de T-cellen zone 8. DCs zijn in nauw contact met stromacellen en kunnen worden waargenomen uitsteekt in de buisvormige conduit structuur om te proeven van vocht en detecteren antigenen 8. De interactie van de lymfeklier stromale cellen (TRC's en LEC's) met DC's wordt gemedieerd door de introductie en presentatie van chemokines CCL21 en CCL19 9,10. CCL19 en CCL21 zijn erkend door de CCR7 receptor faciliteren DC en T-cellen om te migreren naar de lymfeklieren T-cel zone 4,11. Ondanks het gebruik van gelijkaardige chemokines, DC's en T-cellen hebben verschillende migratieroutes naar de lymfeklieren 12. Later, middels enzymatische digestie van de lymfeklieren en isoleren van pure lymfeknoop stromacellen, functionele studies naar de rol van de verschillende lymfeknoop stromale cellen en hun vermogen tot interactie met DCs en T / B-cellen 6,13. Eerst de overspraak tussen IFN-γ producerende effector T-cellen en de lymfeknoop stromale cellen induceert de productie van de metaboliet stikstofoxide aangetoond dat T-cel responsen en proliferatie temperen in de secundaire lymfoïde organen 14-16. Ten tweede, lymfe node stromale cellen gemeld de differentiatie van regelgevende DC subsets ondersteunen via de productie van IL-10 17, en naïeve T cel homeostase moduleren via productie van IL-7 6,18. Ten derde, TLR expressie in lymfeknopen stromale cellen suggereert dat stromale cellen gevoelig voor signaal afgeleid van een infectie of zelf-moleculen model bij weefselbeschadiging. Inderdaad, de behandeling van lymfeklier stromale cellen met de ligand van TLR3 poly (I: C) induceert een bescheiden opregulatie van major histocompatibility complex klasse I expressie en opregulatie van co-remmende eiwit, PD-L1, maar niet die van costimulatoire moleculen, waardoor dramatische veranderingen in perifere weefsels antigenen expressie 19. Verschillende groepen hebben aangetoond lymfeklier stromale cellen brengen perifere weefsel antigenen en veroorzaken tolerantie van zelf-reactieve T-cellen 19,21-27. Daarom begrijpen van de interactie tussen lymfeknoop stromale cellen en andere migrerende en resident lymfeknoopcellen zal helpen om nieuwe targetmoleculen om activering of onderdrukking van de immuunrespons mogelijk te maken tijdens de ontsteking te vinden. Daarom wordt de uitvoering van de gepubliceerde enzymatische scheiding van de lymfeklier nodig.
Eerder verschenen protocollen maken gebruik van verschillende combinaties van collagenase-gebaseerde enzymatische digestie met lage mechanische belasting 6,19,20. Er kunnen lange incubaties met spijsverteringsenzymen of andere combinatie van enzym digestie verschillende oppervlaktemoleculen die nodig is om de activeringsstatus analyseren en nieuwe lymfeknoop stromale cellen te identificeren degraderen. Afhankelijk van het type van de stromale cel analyse, kan het protocol Link Protocol Fletcher of meer geschikt. In de beschreven procedure wordt een iets kortere enzymatische digestie gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om oppervlaktemerker afbraak van levensvatbare lymfeknoop stromacellen minimaliseren. Deze procedure maakt het mogelijk zeer reproduceerbare isolatie enonderscheid lymfeklier stromale cel populaties met lage variabiliteit en meer dan 95% levensvatbaarheid. De vers geïsoleerde lymfeknopen stromale cellen kunnen direct worden gebruikt voor oppervlakte marker expressie, eiwitanalyse, en transcriptionele studies, alsmede het instellen van stromale cellijnen functionele assays in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
De studie lymfeknoopma- stromacellen werd onlangs onderzoek te richten door de ontwikkeling van twee gepubliceerde protocollen digestie 6,13. Beide protocollen zijn voldoende om enkele lymfeknoop stromacellen krijgen maar verschillen in het gebruik van verteringsenzymen en de tijd van de spijsvertering. Aangezien stromale cellen en hun oppervlak markers zijn gevoelig voor enzymatische digestie en mechanische belasting is een geoptimaliseerd protocol vereist.
De isolatie van levens…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.
Materials
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating funktion | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petridishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
Referências
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell – Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
- Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
- Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
- Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
- MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
- Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
- Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
- Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
- Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
- Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618 (2011).
- Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138 (2011).
- Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
- Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
- Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
- Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Lee, J. -. W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
- Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
- Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
- Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
- Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
