Isolering av Murint Lymph Node stromale celler

Summary

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Abstract

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Introduction

Lymfeknuter er spesialiserte avdelinger der adaptive immunresponser mot utenlandske og selvantigener er initiert og koordinert. Fremgangsmåten presentert her beskriver en kort enzymatisk fordøyelse kombinert med automatisert mekanisk pipettering for å oppnå lymfeknute enkeltcellesuspensjon, og få tilgang til levedyktige lymfeknute stromale celler som opprettholder overflaten ekspresjon av flere molekyler.

Lymfeknute stromal celler danner stillaset av lymfeknute og oppfylle tre viktige funksjoner: for det første de filtrerer kroppsvæsker for å prøve antigener, patogener og deres patogen forbindelse molekylmønster (PAMPs) samt cytokiner og fare forbundet molekylmønster (demper) tilstede i legemet. For det andre, de tiltrekker og instruere antigenpresenterende celler (APC) og lymfocytter til å samhandle og initiere adaptive immunresponser; og tredje, gir de en strukturell miljø for homeostase og differensiering av lymfocytter ¹-3. Under betennelse lymfeknute stromale celler produsere vekstfaktorer, cytokiner og chemokiner, tilpasse seg hevelse og dermed organisere samspillet mellom dendrittiske celler (DCS), T-og B-celler. Orkestrering av immunresponser er kun mulig på grunn av den komplekse strukturelle arkitektur dannet av forskjellige stromal cellepopulasjoner.

Lymfeknute stromale celler er CD45 negative celler og kan være preget av uttrykket av CD31 eller gp38 i fibrinoblast og endotelceller ^{en -6.} Gp38 ⁺ CD31 ^– definerer T sone retikulære celler (TRC, også kjent som FRC: fibrinoblast retikulære celler), gp38 ⁺ CD31 ⁺ definerer lymfatiske endotelceller (LMU), gp38 ^– CD31 ⁺ definerer blod endotelceller (BEC). Videre karakterisering av subpopulasjoner avslørte eksistensen av andre lymfeknute stromale celler. Faktisk ble en liten pericyte-lignende cellepopulasjon, karakterisert innenforgp38 ^– CD31 ^– befolkning ^7. Derfor er tilpasning av isoleringsprosedyren fordelaktig for identifisering og karakterisering av de funksjonelle egenskaper av forskjellige lymfeknute stromale celler.

Før utviklingen av lymfeknute stromale celler fordøyelsen protokoller studiet av lymfeknute stromale celler var begrenset til in situ-observasjoner ved hjelp av vev-delen, og mikroskopi. Likevel, strukturelle og funksjonelle studier viste viktige kjennetegn ved lymfeknute stromale celler. Lymfeknute stromale celler er forbundet med podoplanin, kollagen og ekstracellulære matriks (ECM) proteiner for å danne en kompleks tre-dimensjonal struktur kalt ledningssystemet, som transporterer lymfe og forbundet-med lav molekylmasse fra proteiner subkapsulær sinus av lymfeknute til den høye endotelial venules i T-celler sone ^8. DC er i nær kontakt med Stroma celler og kan observeres som stikker ut i rørformet conduit struktur for å prøve væske og oppdage antigener ^åtte. Samspillet av lymfeknute stromale celler (TRC og LMU) med DCs er mediert av utgivelsen og presentasjon av kjemokiner CCL21 og CCL19 ^9,10. CCL19 og CCL21 er anerkjent av CCR7 reseptor tilrettelegge DCs og T-celler til å migrere til lymfeknute T-celle sone ^4,11. Til tross for å bruke lignende kjemokiner, DCS og T-celler har forskjellige trekkruter til lymfeknutene ^12. Senere, ved hjelp av enzymatisk fordøyelse av lymfeknute og isolering av rene lymfeknute stromale celler, ble funksjonelle studier utført på rollen til de ulike lymfeknute stromale celler og deres evne til å samhandle med DC og T / B-celler ^6,13. Først, krysstale mellom IFN-γ produserende effektor-T-celler og lymfeknute stromale celler induserer produksjonen av metabolitten nitrogenoksid vist å dempe T-celle-responser og spredning i de sekundære lymfoide organer ^14-16. Sekund, lymfe node stromale celler er blitt rapportert å støtte differensiering av regulatoriske DC delmengder gjennom produksjonen av IL-10 ^17, og for å modulere naive T-celle-homeostase via produksjon av IL-7 ^6,18. Tredje, TLR uttrykk i lymfeknute stromale celler antyder at stromale celler er utsatt for signal avledet fra en infeksjon eller selv-molekyler utgitt under vevsskade. Faktisk, ved behandling av lymfeknute stromale celler med liganden av TLR3 poly (I: C) induserer en beskjeden oppregulering av store histocompatibility kompleks klasse I ekspresjon og oppregulering av co-inhiberende molekyl PD-L1, men ikke av kostimulerende molekyler, noe som resulterer i dramatiske endringer i perifert vev antigener uttrykket ^19. Flere grupper har vist lymfeknute stromale celler uttrykker perifert vev antigener og indusere toleranse for selvreaktive T-celler ^19,21-27. Derfor forstå samspillet mellom lymfeknute stromale celler og den andre trekkfugl og resident lymfeknute celler vil bidra til å finne nye mål molekyler å tillate aktivering eller undertrykkelse av immunresponser ved betennelse. Derfor er innføringen av den publiserte enzymatisk separasjon av lymfeknute nødvendig.

Tidligere publiserte protokoller bruke ulike kombinasjoner av collagebasert enzymatisk oppslutning med lav mekanisk belastning ^6,19,20. Men kanskje lange inkubasjoner med fordøyelsen enzymer eller annen kombinasjon av fordøyelsen enzym degradere ulike overflatemolekyler som kreves for å analysere aktiveringsstatusen og å identifisere nye lymfeknute stromale celler. Avhengig av hvilken type av stromal celle analyse, kan det hende at Link Protocol eller Fletcher Protocol være mer egnet. I den beskrevne fremgangsmåten, blir en litt kortere enzymatisk fordøyelse kombinert med automatisert mekanisk dekomponering for å minimalisere overflate markør nedbrytning av levedyktige lymph node stromale celler. Denne fremgangsmåten gjør at svært reproduserbare isolasjon ogforskjellsbehandling av lymfeknute stromal cellepopulasjoner med lav variabilitet og mer enn 95% levedyktighet. De nylig isolerte lymfeknute stromale celler kan brukes direkte for overflate markør ekspresjon, proteinanalyse, og transkripsjonelle studier, samt etablering av stromale celler linjer for å utføre funksjonelle analyser in vitro.

Protocol

I denne videoen publisering og protokollen, ble alle prosedyrer dyr utført i henhold til dyret protokoll godkjent av Cantonal Authority Basel-Stadt, Sveits. 1. lymfeknuter Forberedelse og fordøyelse Pre-varme vann i et begerglass til 37 ° C på en magnetrører med varmeplaten. Forbered Basic Medium som følgende: DMEM medium (uten pyruvat) supplert med 2% FCS, 1,2 mM CaCl 2 og Pen / Strep (100 enheter av penicillin, 100 mikrogram av streptomycin). …

Representative Results

Denne protokoll er en modifisert protokoll fordøyelse publisert av Link et al. 2007 6 med en kortere fordøyelse tid (45 min maksimum) på grunn av mekanisk dekomponering med et automatisk flerkanals pipette. I tillegg er fremgangsmåten mer standardisert, minimaliserer nedbrytning av overflatemarkører for forskjellige lymfeknute stromale celler og tillater håndtering av mer enn én prøve på samme tid. Kollagenase IV og Kollagenase D i Links protokoll 6 og…

Discussion

Studiet av lymfeknute stromale celler nylig ble en forskningsfokus på grunn av utviklingen av to publiserte fordøyelsen protokoller ^6,13. Begge protokollene er tilstrekkelig til å få én lymfeknute stromale celler, men skiller seg i bruk av fordøyelsen enzymer og tidspunktet for fordøyelsen. Siden stromale celler og deres overflatemarkører er følsomme for enzymatisk oppslutning og mekanisk påkjenning, er nødvendig for en optimal protokoll.

Isolasjon av levedyktige lymfek…

Materials

DMEM	LifeTechnologies-Gibco	41965-039
FCS			Final concentration 2%
CaCl2	Sigma	499609	Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation		>160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D	Roche	11088882001	use at 3.5 mg/ml
DNAse I	Roche	11284932001	use at 40 µg/ml
stiring magnets	FAUST		5 mm long-2 mm ø
Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml	Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating funktion	IKA-RCT-standard	9720250
Petridishes 100 mm, sterile	TPP	6223201
25G needles	Terumo
anti mouse CD45 Ab	Biolegend		Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab	Biolegend		Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab	Biolegend		Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab	Biolegend		Clone MEC13.3
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel	Eppendorf	4861 000.821/830	1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a	Biolegend		Clone APA5
anti mouse CD80	Biolegend		Clone 16-10A1
anti mouse CD40	Biolegend		Clone 1C10
anti mouse I-Ab	Biolegend		Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)	Biolegend		Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit	Invitrogen	L10119