Visualisation endocytose clathrine de G récepteurs couplés aux protéines à un seul événement résolution par microscopie TIRF
Summary
Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Abstract
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
Introduction
Le processus de clathrine endocytose (CME) dépend de l'arrivée au bon moment des nombreux composants de la machinerie d'endocytose clathrine pour recueillir le fret et manipuler la membrane plasmique dans les vésicules 1-3. CME est initiée par la déformation de la membrane et de la cargaison à l'adaptateur protéines qui se réunissent sur les sites naissantes d'endocytose 1. Ces protéines recrutent la clathrine de protéine d'enveloppe, qui rassemble dans une structure en forme de cage qui forme la fosse recouverts de clathrine (PCC) 4. Une fois que le PCC est entièrement assemblé en une forme sphérique, la scission de la membrane, principalement grâce à l'action de la grande GTPase dynamine, génère gratuits vésicules de clathrine (CCVS) 5,6. Cette internalisation déclenche démontage rapide de la couche de clathrine, permettant aux composants d'être réutilisés pour de multiples séries de CME.
La découverte et la caractérisation des protéines impliquées dans la FMC a été enracinée dans Bioch traditionnelleemical, génétiques, et des techniques de microscopie 4-6,8. Ces essais ont permis d'élucider les rôles et les points d'interaction de ces composants d'endocytose. Bien que très utile pour définir des éléments essentiels de la machinerie de trafic, ces tests sont très limités à capturer le comportement dynamique des composants de FMC ou de la concentration de la cargaison. Il s'agit d'une limitation critique, puisque CME est entraîné par l'ensemble chorégraphié des ensembles de modules de protéines dans les étapes définies, et depuis de petits changements dans la dynamique des événements d'endocytose individuels peut avoir de grandes conséquences cumulatives sur l'endocytose. En outre, des données récentes indiquent que les CCP individuelles peuvent différer à la fois dans la composition et dans le comportement, ce qui suggère que la régulation physiologique de ce processus est très spatialement et temporellement limitée 9-14. Visualisation des événements d'endocytose individuels, par conséquent, il est essentiel de comprendre pourquoi il ya plusieurs protéines impliquées dans redondants CME et b comment ces protéines pourraient être contrôléssignaux physiologiques y pour réglementer cargaison internalisation.
Nous décrivons ici l'utilisation de la réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM) pour observer CME au niveau de la dynamique des contreparties centrales individuelles dans les cellules vivantes. TIRFM repose sur la différence d'indice de réfraction entre la lamelle de verre et l'environnement de fluide de cellules 15,16. Lorsque la lumière d'excitation est dirigée vers les cellules situées plus à l'angle critique, elle est réfléchie à l'intérieur, ce qui crée une onde évanescente qui maintient un champ d'illumination mince s'étendant à peu près 100 nm au-dessus de la lamelle. Cela garantit que seules les molécules fluorescentes dans ce domaine étroit sont excités. En pratique, cela permet à l'excitation des molécules fluorescentes sur ou près de la membrane plasmique, et minimise la fluorescence à partir des parties intérieures de la cellule. Ceci permet d'obtenir un rapport signal sur bruit et la résolution de l'axe z sensiblement plus élevé pour visualiser les événements à la membrane plasmique, compared de modes plus couramment utilisés tels que épifluorescence classique ou microscopie par fluorescence confocale. Nous décrivons également, à une initiation et pratique, l'utilisation d'une image couramment utilisé la plate-forme d'analyse pour analyser et quantifier les caractéristiques et la dynamique des événements individuels cargaison de endocytose morphologiques simples.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici l'utilisation de TIRFM de visualiser endocytose clathrine (CME) au niveau de l'individu CCP dans les cellules vivantes en temps réel. CME est un événement rapide et très dynamique induite par l'effet cumulatif de plusieurs spatialement et temporellement séparées épreuves individuelles. La plupart des tests qui sont actuellement utilisés, tels que les mesures biochimiques de l'internalisation en utilisant biotinylation de surface ou de liaison ligand, la cytométrie de flux ou …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
Referências
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