組織抽出物の高分解能核磁気共鳴分光法によるラット脳のメタボローム解析
Summary
The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).
Abstract
Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.
Introduction
マウスモデルは、脳研究1において広く利用されている。遺伝子型-表現型相関は、他2-6一方でRNAおよび/ またはタンパク質レベルでの遺伝子発現、及び形態学的、機能的、電気生理学的および/ または行動的表現型を研究することによって、マウスおよびラットの脳において研究されてきた。しかし、完全な遺伝子型と表現型の連結機構を理解するためには、下流のタンパク質の発現、 すなわち分子事象を調査するために不可欠である。酵素が7を作用する際の生化学的基質の代謝。この要件は、過去10〜15年間で、生物学8,9の多くの支店での代謝研究のルネサンスに、つながった。古典的な代謝の研究は、多くの場合、特定の経路の詳細に焦点を当ててきたが、新たなメタボロミクスアプローチが検討中の組織のグローバルな代謝プロファイルのすべての包括的な調査を目指している。この概念の1つの結果は、特定の代謝経路および/または化合物のクラスの偏りを最小限にする分析ツールが明らかに必要である。しかし、古典的な生化学的アッセイは、アッセイを行う前に指定する必要がある特定の分析物の特定の化学反応に基づいている。対照的に、核磁気共鳴（NMR）分光法および質量分析（MS）（i）のような分光技術は、生化学的化合物の特定の分子（物理的）特性に基づいて、それぞれがスペクトル中の1つまたはいくつかの別個の信号が生じる一つの実験の過程で検出された。および（ii）実験ごとに異なる多数の化合物を検出する。
このように、各スペクトルは、代謝物の全範囲を組み合わせた情報が含まれています。事前選択は測定されるべき分析物の性質について説明する必要がないので、このような理由から、分光学的方法は、メタボロミクスのための適切なツールである8 </suP>。彼らは大幅に予想外の代謝変化の検出を容易にするため、結果として、これらの技術は、自然探索の研究に役立つ。
NMR分光法およびMSは、多くの代謝物の分析のために交換可能に使用することができますが、それぞれの方法は、最近10日された特定の長所と短所を持っています。簡潔には、NMR分光法は、通常、粗抽出物から行うことができ、分析の前にサンプル化合物のクロマトグラフ分離を必要としない。対照的に、MSは、質量分析イメージングのような特定の最近の発展を除いて、ガスまたは液体クロマトグラフィー（GCまたはLC）分離で動作する。異なる糖の共振線路は、プロトン（1 H）NMRスペクトルにおいて有意に重なるので、そのような糖の分析のようないくつかの特殊なケースでは、LC分離は、同様にNMR分光法のための必需品となってもよい。 CHRのないそれにもかかわらず、1 H NMR分光法omatographic分離は最も人気のある、ほぼ普遍的に適用されたメタボロミクスNMR法のまま。一般的に、サンプル調製は、NMR分光法の場合よりもMSのためのより多くの時間がかかり、複雑である。マトリックス効果に起因する深刻な問題は、彼らが大幅に減衰された信号につながる可能性があり、MSに比べてNMR分光法であまり一般的である。代謝産物の定量は、いずれの方法で達成することができる。しかし、複数の標準化合物に起因代謝産物間のマトリックス効果及びイオン化効率の変動にMSのために必要とされる。適切な測定条件で、後者の方法は本質的に観察された核によって厳密に線形NMR応答を定量的おかげであるため、これとは対照的に、試料ごとに1つの標準は、NMR分光分析に必要とされる。 NMRの主な欠点は、その比較的低い感度である。 MSは、特定のLC-MSで、数桁NMRよりも敏感である。この理由のために、MSは、NMRのために好まれるべきである非常に低い濃度で存在する化合物の分析。一方、NMR実験の非破壊的性質は、MSを超える明確な利点である。このように、NMRは、1 H、リン31（31 P）、炭素13（13 C）、フッ素-19（19 F）などの異なるNMR活性核のために、 例えば 、同じサンプルを繰り返し実行することができるなど 、MS測定とは対照的にない物質がNMRによって消費されないように。
NMRおよびMSの両方が異なるモードで使用することができ、それぞれが特定の化学的特性を有する化合物の検出のために最適である。ほとんど全てのリン酸化された代謝物はまた、プロトンを含んでいますが、例えば、31 P NMRは、多くの場合、適度に集中し、リン酸化化合物の分析のための1 H-NMRより適しています。後者はしかし、それらの1 H NMRシグナルは、他の、非リン酸化化合物の1 H NMRシグナルによって不明瞭にすることができる明らかに31 P NMRスペクトルにバックグラウンド信号は発生しません。 13 C NMRの特別な場合は、ほぼ独占的に重要である一方、アナログ状況では、19 F NMR分析は、フッ素化化合物、 例えば 、フッ素化剤（内因性代謝からのない背景信号）のために好ましいことがあるかの13 Cの運命により13 C同位体（ 約 1％）の非常に低い天然存在度に、続いする必要がある外因性の代謝前駆体を標識した。多くの質量分析計は、陰イオンモードまたは陽イオンモードのいずれかで動作します。したがって、観察されるイオンは正または負に帯電しているかどうかを先に分析知ることが重要である。この方法は、低コストで重要な代謝物濃度の多数を生じるので、私たちはサンプル調製aのに必要な（i）の時間的に1 Hおよび31 P NMR分光法による脳組織のメタボロームを分析するためのプロトコルに焦点を当てるND（ⅱ）の努力は、代謝物の定量のために必要。全ての実験は、標準的な湿式化学実験室の装置および高分解能NMR分光機能を用いて行うことができる。さらなる要件は、以下のプロトコルの項に記載されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
NMR分光法は、非常に再現性および正確な方法で、溶液中の化学物質の濃度を測定するための効率的な方法である。しかし、高品質のデータを得るために、サンプル調製および分析に関する特定の規則を遵守する必要がある。観察されたシグナルの強度が検出閾値（特に弱い信号）に近づくない限り、NMR分光法による代謝産物濃度の測定では、生成もNMR信号の受信のいずれも、定量誤差を支配…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support by Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 and 7339) is gratefully acknowledged.
Materials
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15-mL, 30-mL tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10-mL volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96 % deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96 % deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20 % in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30 % in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Pesquisa | With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
Referências
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