Telomeraseaktivitet i de forskellige regioner i Mouse Brain: Ikke-radioaktivt Telomerase Gentag Amplifikationsprotokol (TRAP) Indhold
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
Telomerase, en ribonucleoprotein, er ansvarlig for vedligeholdelse af telomer længde og dermed fremme genomisk integritet, proliferation og levetid. Telomerase beskytter mitokondrier mod oxidativ stress og bibringer resistens over for apoptose, hvilket tyder på dens mulige betydning for overlevende ikke-mitotiske, meget aktive celler, såsom neuroner. Vi har tidligere demonstreret evne af nye telomerase aktivatorer til at øge telomeraseaktivitet og ekspression i de forskellige muse områder af hjernen og beskytte motorneuroner celler fra oxidativ stress. Disse resultater styrker forestillingen om, at telomerase er involveret i beskyttelsen af neuroner fra forskellige læsioner. For at understrege betydningen af telomerase i hjernen, vi her sammenligne aktiviteten af telomerase i mandlige og kvindelige mus hjerne og dens afhængighed af alder. TRAP-analysen er en standardmetode til påvisning af telomerase-aktivitet i forskellige væv eller cellelinier. Her vise vi analysis af telomerase-aktivitet i tre regioner i musehjerne ved ikke-denaturerende proteinekstraktion hjælp CHAPS lyseringsbuffer efterfulgt af modifikation af standard TRAP-assay.
I dette 2-trins assay endogen telomerase elongates en specifik telomerase-substrat (TS primer) ved tilsætning TTAGGG 6 bp gentagelser (telomerase-reaktion). Telomerase reaktionsprodukter amplificeret ved PCR-reaktionen at skabe en DNA-stige af trin 6 bp. Analysen af DNA-stige er lavet af 4,5% høj opløsning agarosegelelektroforese efterfulgt af farvning med meget følsomme nucleinsyrefarve.
Sammenlignet med den traditionelle TRAP-assay, der anvender 32P-mærket radioaktivt dCTP er til DNA-detektion og polyacrylamidgelelektroforese for at løse DNA-stige, denne protokol giver en ikke-toksisk tidsbesparende TRAP-assay til evaluering af telomerase-aktivitet i muse hjerne, hvilket viser evnen til at detektere forskelle i telomerase-aktivitet i de forskellige kvindelige og mandlige mus hjerne region.
Introduction
Telomerase er et ribonukleoprotein sammensat af telomerase-revers transkriptase (TERT), den katalytiske subunit af telomerase, og en RNA-bestanddel (tert). Den kanoniske rolle telomerase er at bevare den korrekte længde af telomerer ved tilsætning af repetitive sekvenser (TTAGGG) til telomer ender derfor fremme genomisk integritet og celleproliferation 1. Yderligere roller blev tilskrevet TERT i celler, dvs det giver resistens over for apoptose induceret af forskellige ødelæggende middel 2, beskytter humane mesenkymale stamceller fra oxidativt stress 3, og spiller en pro-overlevelse rolle i fuldt differentierede neuroner ved sin forening til TIA1 positiv RNA granulat 4.
TERT udtrykkes og aktiv primært i somatiske dividere celler og i de fleste typer af kræft, mens enzymekspression og aktivitetsniveau er stramt reguleret i ikke-delende celler 5,6. Undersøgelser har vist, at i ROdent hjerne bliver påvises ved postnatal dag 10 telomeraseaktivitet, mens TERT-mRNA holdes på et lavere niveau i voksenalderen 7. Andre studier har vist telomerase aktivitet i voksen sub-ventrikulær zone, lugtekolben, hippocampus, og i den voksne lillehjernen og cortex 8. Vi har for nylig påvist, at hidtil ukendte forbindelser, der øger telomerase-ekspression og aktivitet i hjernen og rygmarven, som udøves neurobeskyttende virkninger i N-methyl-D-aspartat (NMDA) – injicerede mus, forsinket indtræden og progression af amyotrofisk lateral sklerose i SOD1 transgene mus og øget overlevelsen af motoriske neuroner i rygmarven af disse mus 9. For helt at forstå pro-overlevelse rolle telomerase i neuroner og i hjernen, er det vigtigt at udvikle en enkel og relativt følsom hurtig analyse til påvisning af telomerase-aktivitet i de forskellige områder af hjernen.
Den telomerisk rEPEAT amplifikationsprotokol (TRAP) er et velkendt følsom analyse kombinere kanoniske aktivitet af telomerase og polymerasekædereaktionen (PCR). I dette assay telomerase tilføjer TTAGGG gentager til en telomerase-substrat (TS primer) oligonukleotid, efterfulgt af PCR-amplifikation, som genererer seks basepar (bp) DNA-stige hjælp TS reverse primer -. ACX 32P-mærket dCTP s anvendes til at detektere lav mængde af PCR-produkter. DNA stigen er løst ved sekventering polyacrylamidgelelektroforese (PAGE). Både intensiteten af DNA-båndene og længden af DNA-stigen afspejler mængden af aktivt enzym-molekyler og deres processivitet henholdsvis 10.
Denne traditionelle analyse besidder nogle store problemer: Faren for at blive udsat for radioaktive stoffer, store og svært at håndtere sekventering siden og tidsforbrug af gelen kørende og film eksponering af det radioaktive produkt (natten over i begge tilfælde). </p>
Denne protokol giver en forbedret ikke-radioaktive agarose mini-gel-baseret assay. DNA 6 bp stigen er løst ved hjælp af 4,5% høj opløsning agarosegel, og påvisning opnås ved anvendelse af meget følsomme nucleinsyrefarve. Kombinationen af ved hjælp af højtopløsende agarose mini-gel og følsom nucleinsyrefarve nem at håndtere assay eliminerer faren for udsættelse for radioaktivitet, og forkorte den samlede analyse varighed fra 3 dage til adskillige timer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse af telomerase-aktivitet i mus hjernen via TRAP-assayet består af fire hovedtrin: 1) proteiner ekstraktion fra specifikke områder af hjernevæv 2) TS primerforlængelse ved telomerase – telomerase-reaktion 3) amplifikation af telomerase-reaktionsprodukter ved PCR 4 ) separation af PCR-produkter ved hjælp af høj opløsning agarosegel.
Denne modificerede TRAP assay behandler to store problemer, der rejser sig fra den traditionelle analyse: anvendelse af radioaktive dCTP er til føls…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
Referências
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
