פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
Telomerase, ribonucleoprotein, הוא אחראי לשמירה על אורך הטלומרים ולכן קידום יושרה, התפשטות, ותוחלת חיים הגנומי. בנוסף, telomerase מגן על המיטוכונדריה מלחץ חמצוני ומעניק התנגדות לאפופטוזיס, המצביע על החשיבות האפשרית שלו שלשרד של אי mitotic, תאים מאוד פעילים כגון תאי עצב. אנחנו הוכיחו בעבר את היכולת של מפעילי telomerase רומן להגביר את פעילות telomerase וביטוי באזורים במוח העכבר השונים ולהגן על תאי הנוירונים מוטוריים מלחץ חמצוני. תוצאות אלו מחזקות את הרעיון שtelomerase מעורב בהגנה על תאי עצב מנגעים שונים. כדי להדגיש את תפקידו של telomerase במוח, אנחנו כאן להשוות את הפעילות של telomerase במוח עכבר זכר ונקבה ואת תלותה בגיל. assay TRAP הוא שיטה סטנדרטית לאיתור פעילות telomerase ברקמות שונות או שורות תאים. כאן אנו מדגימים את analyאחות של פעילות telomerase בשלושה אזורים במוח העכבר על ידי שאינו denaturing הפקת חלבון באמצעות בחורים תמוגה חיץ ואחריו שינוי של assay TRAP הסטנדרטי.
ב assay 2-שלב זה, telomerase אנדוגני מתארך מצע ספציפי telomerase (פריימר TS) על ידי הוספת TTAGGG 6 חזרות נ"ב (תגובת telomerase). תוצרי תגובת telomerase הם מוגברים על ידי תגובת PCR יצירת סולם DNA של 6 תוספות נ"ב. הניתוח של סולם DNA נעשה על ידי 4.5% ג'ל אלקטרופורזה agarose ברזולוציה גבוהה ואחרי צביעה עם כתם חומצת גרעין רגיש מאוד.
בהשוואה לassay TRAP המסורתי שעושה שימוש ב32 P כותרת dCTP של רדיואקטיביים לגילוי DNA וג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide לפתרון סולם DNA, פרוטוקול זה מציע זמן שאינו רעיל חיסכון assay מלכודת להערכת פעילות telomerase במוח העכבר, הממחיש את היכולת לזהות הבדלים בtelomerasפעילות דואר באזור במוח עכבר הנשי וגברי השונים.
Introduction
Telomerase הוא ribonucleoprotein המורכבת מtelomerase ההפוך transcriptase (טרט), למקטע הקטליטית של telomerase, ומרכיב RNA (TERC). התפקיד הקנוני של telomerase הוא לשמר את האורך הנכון של הטלומרים על ידי הוספת רצפים חוזרים (TTAGGG) לקצות telomeric, לכן קידום יושרת גנומי, ותא התפשטות 1. תפקידים נוספים יוחסו לטרט בתאים, כלומר היא מעניקה התנגדות לאפופטוזיס הנגרם על ידי סוכן מזיק שונים 2, מגן על תאי גזע mesenchymal אדם מלחץ חמצוני 3, ומשחק תפקיד הפרו הישרדות בתאי עצב מובחן באופן מלא על ידי הקשר שלה לTIA1 RNA החיובי גרגרים 4.
טרט מתבטא ופועל בעיקר בתאים סומטיים החלוקה וברוב סוגי הסרטן, ואילו רמות ביטוי אנזים והפעילות מוסדרות בחוזקה בתאי החלוקה הלא 5,6. מחקרים הראו כי בrמוח אודנט, פעילות telomerase הופך בלתי ניתנת לגילוי על ידי לאחר לידה יום 10, בעוד טרט mRNA נשמר ברמות נמוכות יותר בבגרותם 7. מחקרים אחרים הראו פעילות telomerase בתוך האזור הבוגר תת חדרית, הנורה חוש הריח, ההיפוקמפוס, ובמוח הקטן המבוגר והקליפה 8. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי תרכובות רומן המגבירות ביטוי telomerase ופעילות במייתרי המוח ועמוד השדרה הפעילו השפעות נוירו בN-מתיל-D-aspartate (NMDA) – עכברים שהוזרקו, עכבו את תחילתו ואת התקדמות המחלה הטרשת לרוחב amyotrophic במהונדס SOD1 עכברים והגדילו את ההישרדות של תאי עצב מוטוריים בחוט השדרה של עכברים אלה 9. כדי להבין את התפקיד הפרו הישרדות של telomerase בתאי עצב ובמוח באופן מלא, זה חיוני כדי לפתח assay מהיר פשוט ויחסית רגיש לזיהוי של פעילות telomerase באזורים השונים של המוח.
R telomericפרוטוקול ההגברה EPEAT (TRAP) הוא assay רגיש ידוע שילוב הפעילות הקנוני של telomerase ותגובת השרשרת של פולימראז (PCR). ב assay זה, telomerase מוסיף TTAGGG חוזר למצע telomerase (פריימר TS) oligonucleotide, ואחריו ההגברה PCR אשר מייצרת 6 זוגות בסיס סולם DNA (נ"ב) באמצעות TS פריימר ההפוכה -. ACX 32 P כותרת dCTP של המשמשים לאיתור כמות נמוכה של מוצרי PCR. סולם DNA נפתר על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide רצף (עמוד). שתי עוצמת להקות DNA ואורכו של סולם DNA משקפים הסכום של מולקולות אנזים פעילים וprocessivity בהתאמה 10.
assay המסורתי זה מחזיק כמה קשיים עיקריים: הסכנה של חשיפה לחומרים רדיואקטיביים, גדולים וקשים להתמודד עמוד רצף והצריכה של ריצת ג'ל הזמן וחשיפת סרט של מוצר רדיואקטיבי (לילה בשני המקרים). </p>
פרוטוקול זה מציע assay משופר אינו רדיואקטיביים agarose מיני ג'ל המבוסס. הסולם נ"ב DNA 6 נפתר באמצעות 4.5% agarose ג'ל ברזולוציה גבוהה והאיתור מושגת באמצעות כתם חומצת גרעין רגיש מאוד. השילוב של שימוש ברזולוציה גבוהה agarose מיני ג'ל וכתם חומצת גרעין רגיש מציע קל לטפל assay, מבטל את הסכנה של חשיפה לקרינה רדיואקטיבית ולקצר באופן משמעותי את משך זמן assay הכולל מ3 ימים לכמה שעות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח של פעילות telomerase במוח העכבר באמצעות assay TRAP מורכב מ -4 שלבים עיקריים: 1) חלבוני חילוץ מאזורים ספציפיים של רקמת המוח 2) TS התארכות פריימר על ידי telomerase – תגובת telomerase 3) הגברה של תוצרי תגובת telomerase על ידי 4 PCR הפרדה) של מוצרי PCR באמצעות ג'ל agarose ברזולוציה גבוהה.
<p class="jove_content…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
Referências
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
