Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
Telomerase, ein ribonucleoprotein, ist für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge und damit die Förderung der genomischen Integrität, Proliferation und Lebensdauer verantwortlich. Darüber hinaus schützt die Telomerase Mitochondrien aus oxidativem Stress und verleiht Resistenz gegenüber Apoptose, was seine mögliche Bedeutung für das Überleben der nicht-mitotischen hochaktive Zellen, wie Neuronen. Wir haben bereits gezeigt, die Fähigkeit der neuen Telomerase-Aktivatoren, um die Telomerase-Aktivität und Expression in den verschiedenen Hirnregionen der Maus zu erhöhen und die motorischen Nervenzellen Zellen vor oxidativem Stress zu schützen. Diese Ergebnisse stärken die Vorstellung, dass die Telomerase in den Schutz von Neuronen vor verschiedenen Läsionen beteiligt. Um die Rolle der Telomerase im Gehirn unterstreichen, hier vergleichen wir die Aktivität der Telomerase in männlichen und weiblichen Maus Gehirn und seine Abhängigkeit vom Alter. TRAP-Assay ist ein Standardverfahren zum Nachweis von Telomerase-Aktivität in verschiedenen Geweben oder Zelllinien. Die Analy Hier zeigen wirsis der Telomerase-Aktivität in drei Regionen des Mäusehirns durch nicht-denaturierenden Protein-Extraktion unter Verwendung von CHAPS Lysepuffer gefolgt von Modifikation der Standard-TRAP-Assay.
In diesem 2-Schritt-Assay, verlängert endogenen Telomerase eine bestimmte Telomerasesubstrat (TS-Primer) durch Zugabe von 6 bp TTAGGG Wiederholungen (Telomerase-Reaktion). Die Telomerase-Reaktionsprodukte durch PCR-Reaktion die Schaffung einer DNA-Leiter mit 6 bp-Schritten amplifiziert. Die Analyse der DNA-Leiter wird durch 4,5% Agarose hochauflösende Gelelektrophorese, gefolgt von Anfärben mit hochempfindlichen Nucleinsäure-Färbung.
Im Vergleich zu den traditionellen TRAP-Assay, nutzen 32 P markierten radioaktiven dCTP für DNA-Detektion und-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Lösung des DNA-Leiter, bietet das Protokoll eine nicht-toxische Zeitersparnis TRAP-Assay zur Auswertung der Telomeraseaktivität im Gehirn der Maus, demonstrieren die Fähigkeit, erkennen Unterschiede in telomerasE-Aktivität in den verschiedenen weiblichen und männlichen Gehirn der Maus Region.
Introduction
Telomerase ist ein Ribonukleoprotein-Telomerase zusammen Reverse Transkriptase (TERT), der katalytischen Untereinheit der Telomerase-RNA-Komponente und eine (TERC). Die kanonische Funktion der Telomerase ist, um die richtige Länge der Telomere durch Zugabe von repetitiven Sequenzen (TTAGGG) an die telomeren Enden, damit die Förderung der genomischen Integrität und Zellproliferation 1 erhalten. Weitere Rollen wurden in TERT-Zellen zurückzuführen, dh Resistenz gegen Apoptose durch verschiedene schädigende Mittel induziert 2 schützt humanen mesenchymalen Stammzellen vor oxidativer Beanspruchung 3, und spielt eine überlebens Rolle vollständig differenzierten Neuronen durch seine Verbindung zum positiven RNA TIA1 Granulat 4.
TERT exprimiert wird, und vor allem in Körperteilenden Zellen und in den meisten Krebsarten aktiv ist, während die Enzymexpression und Aktivität sind fest in nicht-teilenden Zellen 5,6 geregelt. Studien haben gezeigt, dass das ROdent Gehirn, wird die Telomerase-Aktivität nicht nachweisbar durch postnatalen Tag 10, während TERT mRNA wird auf den unteren Ebenen bis ins Erwachsenenalter 7 gehalten. Andere Studien zeigten, Telomeraseaktivität in der Erwachsenenunter ventrikulären Zone, dem Riechkolben, dem Hippocampus und im Cortex und Cerebellum Erwachsenen 8. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass neue Verbindungen, die Telomerase-Expression und Aktivität im Gehirn und Rückenmark zu erhöhen ausgeübt neuroprotektive Effekte in N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) – injizierten Mäusen, verzögert die Entstehung und das Fortschreiten der Krankheit Amyotrophe Lateralsklerose in SOD1 transgenen Mäuse und erhöhte das Überleben von Motoneuronen im Rückenmark von diesen Mäusen 9. Um die überlebens Rolle der Telomerase in Neuronen im Gehirn zu verstehen, ist es wichtig, ein einfaches und relativ empfindlich schnelle Methode zum Nachweis von Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Bereichen des Gehirns zu entwickeln.
Die Telomer-repeat Amplifikationsprotokoll (TRAP) ist eine bekannte empfindliche Assays Kombinieren des kanonischen Aktivität der Telomerase und der Polymerasekettenreaktion (PCR). In diesem Assay fügt Telomerase TTAGGG Wiederholungen für eine Telomerase-Substrat (TS-Primer) Oligonukleotid, gefolgt von PCR-Amplifikation mit 6 Basenpaaren (bp)-DNA-Leiter mit der TS Rückwärtsprimer erzeugt -. ACX 32 P markiertem dCTP werden verwendet, um die Erfassungs geringe Menge an PCR-Produkten. Die DNA-Leiter wird durch Sequenzierung Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gelöst. Sowohl die Intensität der DNA-Banden und die Länge der DNA-Leiter spiegeln die Menge an aktiven Enzymmolekülen und ihre Prozessivität bzw. 10.
Das traditionelle Test hält einige größere Schwierigkeiten: Die Gefahr der Belastung durch radioaktive Stoffe, groß und schwer, Sequenzierung PAGE und der Zeitaufwand des Gels Laufen und Filmbelichtung des radioaktiven Produkt (über Nacht in beiden Fällen) zu behandeln. </p>
Dieses Protokoll bietet eine verbesserte nicht-radioaktiven Agarose-Gel-Mini-basierte Assays. Die DNA 6 bp-Leiter wird mit 4,5% hochauflösende Agarose-Gel aufgetrennt und die Detektion erfolgt mittels hochempfindlicher Nukleinsäure Fleck. Die Kombination von hoher Auflösung mit Agarose-Gel-Mini und empfindliche Nukleinsäurefärbung bietet einfach zu hand Assay, beseitigt die Gefahr der Radioaktivität ausgesetzt sind und die Gesamtdauer Assay 3 Tagen deutlich verkürzen, um mehrere Stunden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse von Telomerase-Aktivität in Gehirn der Maus über die TRAP-Assay besteht aus 4 Schritten: 1) Extraktion von Proteinen spezifische Bereiche des Hirngewebes 2) TS Primerverlängerung durch Telomerase – Telomerasereaktion 3) Amplifikation der Telomerase-Reaktionsprodukte durch PCR 4 ) Auftrennung der PCR-Produkte mit hoher Auflösung Agarosegel.
Diese modifizierte TRAP-Assay befasst sich mit zwei Hauptschwierigkeiten, die sich aus der traditionellen Assay steigen: die Verwendung von ra…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
Referências
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