שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח
Summary
טכניקות מסורתיות לבודת ג'ל polyacrylamide (PA) המכיל בדיקות ניאון כרוכות הרבדה ג'ל בין משטח חסיד ושקופיות זכוכית. כאן, אנו מראים כי ציפוי שקופית זו עם פולי-D-ליזין (PDL) ובדיקות ניאון מתאים את הבדיקות לבתוך 1.6 מיקרומטר ממשטח ג'ל.
Abstract
ג'לי הרשות הפלסטינית כבר מזמן משמש כפלטפורמה ללימודי כוחות מתיחת תא בשל הקלות של זיוף ואת היכולת לכוון תכונות האלסטיות שלהם. כאשר המצע מצופה בחלבון מטריצת החוץ תאי, תאים לדבוק בג'ל ולהחיל כוחות, גורמים לג'ל כדי לעוות. העיוות תלויה במתיחת התא ותכונות אלסטיות של ג'ל. אם שדה העיוות של פני השטח ידוע, מתיחת פני השטח יכולה להיות מחושבת באמצעות תיאורית הגמישות. עיוות ג'ל נמדדה בדרך כלל על ידי הטבעת חרוזים סמן פלואורסצנטי אחיד לתוך הג'ל. הבדיקות לעקור כג'ל מעווה. הבדיקות סמוך לפני השטח של ג'ל מתבצעות מעקב. ההתקות שדווחו על ידי בדיקות אלה נחשבות התקות משטח. מעמקיהם מפני השטח הם התעלמו. הנחה זו מציגה שגיאה בהערכות כוח המתיחה. למדידה מדויקת של כוחות התא, זה קריטי למיקומו של חרוזים להיות ידוע. פיתחנוטכניקה המשתמשת בכימיה פשוטה להגביל את חרוזים סמן פלואורסצנטי, 0.1 ו1 מיקרומטר בקוטר, בג'לים הרשות הפלסטינית, תוך 1.6 מיקרומטר של פני השטח. אנו מעיל coverslip עם פולי-D-ליזין (PDL) וחרוזי ניאון. פתרון ג'ל הרשות הפלסטינית הוא דחוק אז בין coverslip ומשטח חסיד. חרוזי הניאון להעביר לפתרון ג'ל במהלך ריפוי. לאחר פילמור, ג'ל הרשות הפלסטינית מכיל חרוזי ניאון בקרבת מטוס אל פני השטח ג'ל.
Introduction
האינטראקציה המכנית של תא חי עם הסביבה המקומית שלה בדרך כלל נחקרה באמצעות ג'לים הרשות הפלסטינית. מצעים אלה מסתמכים על פרוטוקול פשוט, מאופיין היטב שהוקם על ידי דמבו וואנג ב -1997 1. אחד היתרונות העיקריים של מצעים אלו הוא שהנוקשות שלהם עשויות להיות מכוונת על ידי שינוי הריכוזים של רכיבים ספציפיים של פתרון ג'ל. זה מספק פלטפורמה רצויה ללמוד אינטראקציה של תאים עם סביבה של קשיחויות שונות. כאשר ג'לי הרשות מצופה במטריצה תאית חלבונים (ECM), תאים לדבוק, יצירת כוח. כתוצאה מכוח התא, ג'ל מעווה כגוף אלסטי. עיוות זה תלויה בגודלו של הכח המופעל על ידי התאים ותכונות אלסטיות של ג'ל. מחקרים שונים מועסקים ג'לי הרשות הפלסטינית לחקור כוחות מתיחה סלולריים.
בוריאציה אחת של ייצור ג'ל הרשות הפלסטינית, microspheres ניאון (חרוזים) מוטבע throughout ג'ל לכמת כוחות מתיחת תא על ג'לים של קשיחויות שונות 2. במועד יישום כוח התא, חרוזים לעקור מהמיקום הראשוני שלהם בעקבות עיוות ג'ל. שדה העיוות נמדד מהתקות חרוז בודדות. שדה עיוות זה מנוצל עם תיאורית הגמישות ותכונות האלסטיות של ג'ל כדי לחשב את כוחות המתיחה. מדידות אלה מספקים תובנה לגבי הדרך בה התאים באופן מכאני לחוש וליצור אינטראקציה עם microenvironment המקומי שלהם 3.
בפרוטוקולים של הרשות הפלסטינית בשימוש נרחב הרבה ייצור ג'ל, חרוזים מתערבבים לאורך ג'ל הרשות הפלסטינית במצב הנוזלי, unpolymerized. ג'ל רשות polymerized מלא מכיל חרוזי ניאון לאורך כל הנפח שלה. בחישוב כוחות מתיחת תא, חרוזים ביותר בקרבת פני השטח ג'ל (ממשק תא מצע) נמצאים תחת פיקוח. ההתקות של חרוזים אלה הניחו להתרחש על פני השטח תרבית תאים לפשטות בcalculatio הכוחn. המיקום בפועל של חרוזים בתוך העומק של ג'ל התעלם. עם זאת, במדיום אלסטי (כגון ג'ל הרשות הפלסטינית), חרוז קרוב יותר לנקודה של הפעלת כוח יהיה להעביר יותר מחרוז שהוא רחוק יותר מהנקודה. לפיכך, טיפול בתזוזה של נקודה (במיקום חרוז) דיסטלי מפני שטח שכבתוצאות המשטח בהערכה נמוכה מדי של tractions הסלולרי. מידת השגיאה תלויה במרחק של חרוז מהמשטח. השגיאה לא ניתנת לביצוע ללא הידיעה של המיקום של חרוז.
הצורך בשיטה פשוטה להגביל את חרוזים מאוד קרובים לפני שטח תרבית תאים טופל על ידי כמה טכניקות. דרך אחת היא להגדיל את הצפיפות של חרוזים לאורך כל ג'ל כזה שיש מספר מספיק של חרוזים במישור המוקד העליון למדוד תנועה מאוד קרוב לפני השטח. טכניקה נוספת כרוכה בבניית חדר הדמיה confocal הדמיה תא חי, כך שהאור מרק חרוזים במטוס העליון ביותר מוקדי נאספו 4. שיטה אחרת כרוכה כיסתה שכבה דקה מאוד של ג'ל הרשות הפלסטינית המכיל חרוזים על גבי ג'ל polymerized כבר בלי חרוזים 5. חסרון של כל אחד מטכניקות אלה הוא כי המיקום המדויק של חרוזים בתוך הג'ל אינו ידוע. זה מציג שגיאה בחישוב של שדה התזוזה של חרוזים, ובכך החישוב של כוחות התא. טכניקה נוספת כרוכה נטיה של חרוזים למשטח העליון של ג'ל הרשות הפלסטינית כבר polymerized באמצעות Sulfo-SANPAH 6. טכניקה זו מבטיחה את חרוזים הם אכן רק על החלק העליון של ג'ל הרשות הפלסטינית, אך שבה הם משובצים בעומק של ג'ל המידה אינה ידועה. זה עלול ליצור טופוגרפיה מקומית לתאים, אשר יכול לשנות את התנהגות תא, כמו עבודות קודמות הציעו כי תאים יכולים לחוש כמה מיקרונים כוח משם 7. לאחרונה, טכניקה עבור דפוסי ג'לי הרשות הפלסטינית בקוטר 1 מיקרומטר fסמני נקודת פיברונקטין luorescent במערך מוסדר הוקם 8. במקרה זה, את העומק של סמני הניאון ידוע, והוא במהות אפס, כדפוס פיברונקטין מודפס בעקיפין על פני השטח ג'ל. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת סביבה מתמשכת שבו תאים יכולים לצרף, כחלבון ECM מוגבל ל1 מיקרומטר נקודות קוטר. שיטה לשילוב מלא של חרוזים גשש בתוך ג'לי הרשות הפלסטינית ורתק אותם למיקום ידוע מאוד קרובים לפני השטח עדיין לא הוקמה.
כאן, אנו מפתחים טכניקה להגבלה תת מיקרומטר לחרוזי ניאון קוטר מיקרומטר למישור מוקד מאוד קרוב לפני שטח תרבית תאים בתוך ג'ל הרשות הפלסטינית. ג'ל הוא נרפא בדרך כלל על ידי הרבדה פתרון ג'ל הנוזלי unpolymerized בין שני לוחות זכוכית. אחד מהלוחות הוא פונקציונליות, כך שג'ל חזק דבק בו. האחרים הוא unfunctionalized והוא הוסר לאחר ריפוי ג'ל. אנו לשנות זכוכית נשלפת זה surface על ידי ציפויה בשכבה של חרוזים. על הרבדה ג'ל הנוזלי בין פונקציונליות ומשטח זכוכית חרוז מצופה, העברת חרוזים לג'ל בזמן שהוא הריפוי. זה מגביל את המרחק של האינטגרציה "חרוזים לתוך הג'ל בתוך 1.6 מיקרומטר של פני השטח. הזכוכית תחתון מנות פטרי משמשות כמשטח חסיד שבג'ל הוא נרפא. כדי ליצור משטח ג'ל עליון שטוח במהלך פילמור, להחליק את מכסה זכוכית עגולה משמש לכריך ג'ל עם צלחת פטרי הזכוכית תחתונה. לפני ייצור ג'ל, להחליק את מכסה זכוכית העליון מצופה בפולי-D-ליזין (PDL), מניב תשלום משטח חיובי. PDL הוא התפוצץ עם אוויר דחוס, ופתרון של חרוזים במים מופקד על המכסה מחליק. אנו מנצלים microbeads ניאון carboxylated, אשר נושא מטען שלילי, וליצור אינטראקציה עם משטח מטען החשמלי החיובי שנוצר על ידי טיפול עם PDL. לאחר פיצוץ פתרון חרוז את coverslip עם אוויר דחוס, שכבה יחידה שלחרוזים נשאר יחד אלקטרוסטטי ללהחליק את המכסה היבשה. ציפוי PDL אינו משפיע על הדביקות של הזכוכית על פני השטח ג'ל, כמו שקופיות הזכוכית אינן פגומות והוסר מג'ל הרשות הפלסטינית שלם באופן מלא.
צלחות פטרי הזכוכית תחתונה עשויות חסיד על ידי טיפול עם 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane וglutaraldehyde 0.5%. ג'לים של הרשות הפלסטינית קשיחויות הרצויות נוצרים על ידי ערבוב ריכוזים מתאימים של bisacrylamide וacrylamide באמצעות הליך סטנדרטי 9. טיפה של פתרון ג'ל היא pipetted על צלחת פטרי הזכוכית תחתונה. להחליק את מכסה זכוכית המכילים חרוזים משמש לכריך ג'ל עם צלחת פטרי. כאשר ג'ל הוא נרפא, להחליק את המכסה העליון הוסר עוזב את חרוזים משובצים בג'ל הרשות הפלסטינית בתוך 1.6 מיקרומטר מהמשטח.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעת שימוש בטכניקה זו, הוא חיוני, כי פתרון חרוז מדולל כראוי והחרוזים נבחרים על בסיס קוטר רצוי, נוקשות הרשות הפלסטינית מצע ג'ל, והגודל בקנה המידה של התופעות שנחקרו בניסוי הרצוי.
יש לנקוט זהירות בעת דילול פתרון חרוז לפני functionalizing תל…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות תכנית היוזמה הבינתחומי החדשנות, אוניברסיטת אילינוי, להעניק 12035. SK מומן בUIUC מהקרן הלאומית למדע גרנט (NSF) 0,965,918 IGERT: הכשרת הדור הבא של חוקרים בניידים ומכניקה מולקולרית וBioNanotechnology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Reagents | ||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 |
| 1M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 |
| 0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 |
| Fibronectin, Human, 1mg | BD Biosciences | 354008 |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 161-0700 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 |
| .05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 |
| NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Acrylic Acid | Sigma-Aldrich | 147230 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 |
| Materials | ||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 |
Referências
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , (2010).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -. A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
- Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic, M. L., Smith, A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , 16 (2010).
- Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
- Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
- Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
- Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
- Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
- Atanackovic, T., Guran, A. . Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).
