En ny metode for lokalisering Reporter fluoriserende perler Nær Cell Culture Surface for trekkraft Mikros

Summary

Tradisjonelle teknikker for å fabrikkere polyakrylamid (PA) geler inneholdende fluorescerende prober innebære sandwiching en gel mellom en vedheftende overflate, og en glass-slide. Her viser vi at belegg dette lysbildet med poly-D-lysin (PDL) og fluorescerende prober lokaliserer sondene til innenfor 1,6 mikrometer fra gelen overflaten.

Abstract

PA geler har lenge vært brukt som en plattform for å studere celletrekkrefter pga lett fabrikasjon og evnen til å stille sine elastiske egenskaper. Når substratet er belagt med et ekstracellulært matriksprotein, celler holder seg til gelen og anvende krefter, noe som fører til at gelen deformeres. Den deformasjon avhenger av celle trekkraft og de elastiske egenskapene til gelen. Hvis deformasjonen feltet på overflaten er kjent, kan overflate trekkraft bli beregnet ved hjelp av elastisitetsteori. Gel deformasjon blir vanligvis målt ved å inkludere fluorescerende markør perler jevnt inn i gelen. Sondene fortrenge som gel deformeres. Probene i nærheten av overflaten av gelen blir sporet. De forskyvninger er rapportert av disse sonder er ansett som overflateforskyvninger. Deres dybder fra overflaten blir ignorert. Denne antakelsen introduserer feil i trekkraft evalueringer. For nøyaktig måling av cellekrefter, er det avgjørende for plasseringen av perlene for å være kjent. Vi har utvikleten teknikk som benytter enkel kjemi å begrense fluorescerende markør perler, 0,1 og 1 mikrometer i diameter, i PA-geler, innen 1,6 mikrometer på overflaten. Vi frakk en dekkglass med poly-D-lysin (PDL) og fluoriserende perler. PA gel-løsning blir deretter klemt mellom dekkglass og et vedheftende overflate. De fluorescerende perler overføring til gel-løsning under herding. Etter polymeriseringen, inneholder PA gel fluorescerende perler på et plan i nærheten av geloverflaten.

Introduction

Den mekaniske interaksjonen mellom en levende celle med sin lokale miljøet har ofte blitt studert ved hjelp av PA gels. Disse substrater er avhengig av en enkel, godt karakterisert protokoll etablert av Dembo og Wang i 1997 ^1. En av de viktigste fordelene med disse substrater, er at deres stivhet kan bli innstilt ved å endre konsentrasjonen av bestemte komponenter i gelen løsning. Dette gir en ønskelig plattform for å studere cellenes interaksjon med miljøer av ulike stivheter. Når PA geler er belagt med ekstracellulær matrise (ECM) proteiner, celler holder seg til dem, å generere kraft. Som et resultat av cellekraft, deformerer den gel som et elastisk legeme. Denne deformasjon er avhengig av størrelsen av den kraft som utøves av cellene og de elastiske egenskapene til gelen. Ulike studier har ansatt PA gels å undersøke cellulære veigrep.

I en variant av PA gel fabrikasjon, er fluorescerende mikrosfærer (perler) innebygd throughout gelen å kvantifisere celle trekk kraften på gels av ulike stivheter ^to. Ved celle force program, perler fortrenge fra sin opprinnelige plassering etter gel deformasjon. Den deformasjon felt måles fra de enkelte perle forskyvninger. Denne deformasjon feltet blir utnyttet med elastisitetsteorien, og de elastiske egenskapene til gelen for å beregne de trekkrefter. Disse målingene gir innsikt i hvordan celler mekanisk sanse og samhandle med sine lokale mikromiljøet ^tre.

I mange hyppig benyttede PA-gel fabrikasjons protokoller, blir perlene blandes hele PA gel i sin væske, upolymerisert tilstand. Et fullt polymerisert PA gel inneholder fluoriserende perler i hele sitt volum. Ved beregning av celle veigrep, er perler fleste nærheten geloverflaten (celle-underlaget grensesnitt) overvåkes. De forskyvninger av disse perlene er antatt å forekomme på cellekulturoverflate for enkelhet i kraft calculation. Den faktiske plasseringen av perlene i dybde av gelen er sett bort fra. Imidlertid, i et elastisk medium (for eksempel PA-gel), en limstreng nærmere til et punkt over kraftpåførings vil bevege seg mer enn en limstreng som er lengre borte fra punktet. Således behandler forskyvningen av et punkt (ved vulsten plassering) distalt fra overflaten som det på overflaten resulterer i en undervurdering av cellulære tractions. Graden av feil avhenger av avstanden av vulsten fra flaten. Feilen kan ikke beregnes uten kjennskap til plassering av perlen.

Behovet for en enkel metode for å begrense perler meget nær den cellekulturoverflate er løst ved noen teknikker. En måte er å øke tettheten av perlene i hele gelen, slik at det finnes et tilstrekkelig antall perler i den øverste fokalplanet for å måle bevegelse meget nær overflaten. En annen teknikk innebærer å bygge en konfokal avbildningskammer for levende celle avbildning slik at lyset frabare perlene i det øverste fokalplan samles ^4. En annen metode involverer overlegging av et ekstremt tynt sjikt av PA-gel inneholdende perler på toppen av en allerede polymeriserte gel uten perler ^5. En ulempe ved hver av disse teknikkene er at den nøyaktige plassering av kulene i gelen ikke er kjent. Dette introduserer feil i beregningen av forskyvningsfeltet av kulene, og dermed beregningen av cellekrefter. En annen teknikk omfatter konjugering av perler til den øvre flate av et allerede polymerisert PA under anvendelse av Sulfo-SANPAH ^6. Denne teknikken sørger for perlene er faktisk bare på toppen av PA gel, men i hvilken grad de er innleiret i dybden av gelen er ukjent. Dette kan potensielt skape en lokal topografi for cellene, noe som kan endre celle atferd, som tidligere arbeid har foreslått at cellene kan forstand force flere mikrometer unna ^7. Nylig ble en teknikk for patterning PA geler med 1 mikrometer diameter fluorescent fibronectin punktmarkører i en ordnet rekke ble etablert ^åtte. I dette tilfellet er dybden av de fluorescerende markører er kjent, og er i det vesentlige lik null, som fibronektin mønsteret er trykt på indirekte geloverflaten. Men denne metoden ikke gir en kontinuerlig miljø på hvilke celler kan feste, som ECM protein er begrenset til 1 mikrometer diameter prikker. Har ennå etableres En fremgangsmåte for full integrering av tracker perler innen PA geler og avgrense dem til en kjent posisjon svært nær overflaten til.

Her utvikler vi en teknikk for å begrense sub-mikrometer til mikrometer diameter fluoriserende perler til et fokusplanet svært nær cellekultur overflaten innen PA gel. En gel blir typisk herdet ved sandwiching upolymerisert flytende gel-løsning mellom to glassplater. En av platene er funksjonalisert slik at gelen kleber sterkt til den. Den andre er unfunctionalized og fjernes etter gel botemidler. Vi modifisere denne flyttbare glass surface ved å belegge den med et lag av perler. Ved sandwiching flytende gel mellom funksjonalisert og vulsten belagt glassoverflate, den perler overføring til gel mens den herder. Dette begrenser avstanden av perlene 'integrering inn i gelen innen 1,6 mikrometer på overflaten. Glass-bunn petriskåler ble anvendt som den vedheftende flate der gelen er herdet. For å danne en flat toppoverflate gel under polymeriseringen, er en sirkulær glass dekkglass som brukes til sandwich-gelen med glass-bunn petriskål. Før gel fabrikasjon, er den øverste glass dekkglass belagt med poly-D-lysin (PDL), hvilket ga en positiv overflateladning. Den PDL blåses bort med trykkluft, og en løsning av perler i vann avsettes på dekkglass. Vi bruker karboksylerte fluorescerende microbeads, som bærer en negativ ladning, og samhandle med positivt ladet overflate skapt av behandling med PDL. Etter blåser perlen løsning av dekkglass med trykkluft, et enkelt lag avperler forblir elektro koblet til den tørre dekkglass. Den PDL belegget påvirker ikke klebrighet av glasset til gelen overflate, som glass-slides er uskadet, og fjernes fra PA gel helt intakt.

Glass-bunn petriskåler er gjort klebende ved behandling med 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane og 0,5% glutaraldehyd. PA gelene ønskede stivheter er laget ved å blande egnede konsentrasjoner av akrylamid, og akrylamid via en standard prosedyre ^9. En dråpe av gelen oppløsningen ble pipettert inn i glass-bunn petriskål. Glasset dekkglass inneholdende perlene blir brukt til sandwich-gelen med petriskål. Når gelen er herdet, er den øvre dekkglass fjernes etterlater kulene er innleiret i PA gel i løpet av 1,6 um fra overflaten.

Protocol

Fabrikere og funksjonalise PA geler av varierende stiffnesses med fluorescerende mikrokuler er innebygd i nærheten av cellekulturoverflaten. 1. funksjon Top Glass dekkglass Rene glass dekkglass (# 1.0, 12 mm diam.) Med såpe og vann, etterfulgt av etanol for å fjerne overflødig støv. Plasser glassdeksel glipper på en revet overflate (dvs. pipettespissen holder) slik at de ikke berører å lette enkel interaksjon med dekkglass. Dekk hele overflaten…

Representative Results

Konfokal avbildning ble brukt for å fastslå at perlene var faktisk under gel overflate og for å kvantifisere deres nøyaktige posisjon innenfor den gel dybde. Fluorescent perler av en annen bølgelengde enn de inne i gel ble tillatt å slå seg ned på overflaten, og avstanden mellom de innleirede fluorescerende nanopartikler og de på overflaten ble beregnet ved hjelp av en sentroide identifikasjonsalgoritme. Plasseringen av vulsten på gelen overflaten tjener som en referanse for den øvre overflate av gelen-der ce…

Discussion

Ved bruk av denne teknikk, er det vesentlig at vulsten løsning er riktig fortynnet og perlene blir valgt på grunnlag av ønsket diameter, PA gel substrat stivhet, og størrelsen omfanget av de fenomener som er undersøkt i den ønskede eksperimentet.

Forsiktighet bør utvises ved fortynne perle løsning før funksjon topp glass dekkglass. Avstanden mellom perlene på gelen overflaten kan endres ved å endre fortynningsfaktoren av kolloid oppløsning. Fortynning av oppløsningen for mye vil…

Materials

Name	Company	Catalog Number
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1mg	BD Biosciences	354008
Ammonium Persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCL	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic Acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023