Измерение потоков минеральных питательных веществ и токсикантов в растениях с помощью радиоактивной метки
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
Поглощение и распределение питательных веществ и токсикантов сильно влияют на рост растений. Соответственно, исследование основных транспортных процессов является одним из основных область исследований в биологии растений и сельскохозяйственных наук 1,2, особенно в контекстах питательной оптимизации и экологических стрессов (например, соль стресс, токсичность аммония). Главным среди методов для измерения потоков в растениях является использование радиоизотопных индикаторов, которая была разработана значительно в 1950 (смотри, например, 3) и продолжает быть широко используется сегодня. Другие методы, такие как измерения истощение питательных веществ из корневой среды и / или накопления в тканях, использование ионно-селективных вибрирующих микроэлектродов, такие как MIFE (микроэлектродной ионный оценки потока) и SIET (сканирование ионоселективная техники электрод), и использования ион-селективный флуоресцентные красители, также широко применяется, но ограничены в их способности обнаружить чистую гриппаРЭС (т.е. разница между притоком и оттоком). Использование радиоизотопов, с другой стороны, позволяет исследователю уникальную возможность изолировать и количественно однонаправленные потоки, которые могут быть использованы для решения кинетических параметров (например, К М и V макс), и дать представление о мощности, энергетика, механизмы и регулирование, транспортных систем. Однонаправленные измерения потока, сделанные с радиоактивных индикаторов являются особенно полезными в условиях, когда поток в противоположном направлении высока, а оборот внутриклеточных пулов происходит быстро 4. Кроме того, радиоиндикаторные методы позволяют измерять, которые будут проводиться в довольно высоких концентрациях субстрата, в отличие от многих других методов (см 'Обсуждение', ниже), так как прослеживается изотоп наблюдается на фоне другого изотопа того же элемента.
Здесь мы предоставляем подробные инструкции для радиоизотопного измерения однонаправленной и пET потоки минеральных питательных веществ и токсикантов в целые растения. Акцент будет сделан на измерении потока калия (K +), растительного макро- 5 и аммиака / аммония (NH 3 / NH 4 +), другой макроэлементов, которые, однако, токсичным, когда он присутствует в высоких концентрациях (например, 1- 10 мМ) 2. Мы будем использовать радиоизотопы 42 K + (т 1/2 = 12,36 ч) и 13 NH 3/13 NH 4 + (т 1/2 = 9,98 мин), соответственно, в неповрежденных саженцев модель системы ячменя (Hordeum обыкновенной L .), в описании двух основных протоколов: прямой приток (DI) и полигамное анализа индикаторного оттока (CATE). Отметим, с самого начала, что эта статья просто описывает шаги, необходимые для выполнения каждого протокола. Где это уместно, краткие пояснения расчетов и теории предоставляются, но подробные экспозиции каждой техники'Ы фона и теория может быть найден в нескольких ключевых статей на эту тему 4,6-9. Важно отметить, что эти протоколы в целом подлежит передаче потока анализ других питательных веществ / токсикантов (например, Na +, 24, 22 Na +, Rb + 86, 13 NO 3 -) и других видов растений, хотя и с некоторыми оговорками (смотри ниже) . Мы также подчеркиваем важность того, чтобы все исследователи, работающие с радиоактивными материалами должны работать в соответствии с лицензией, расположенной через ионизирующего регулятора радиационной безопасности их учреждения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как показано в приведенных выше примерах, метод радиотрейсера является мощным средством измерения однонаправленных потоков питательных веществ и токсикантов в Планта. Рисунок 1 показывает, что NH 3 приток может достигать свыше 225 мкмоль г -1 ч -1, которая яв…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
Referências
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G., Lüttge, U., >Pitman, M. .. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. 2 Part A, (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots – A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J., Maathuis, F. .. J. .. M. .. ,. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Volume 953, 161-170 (2013).
- Meeks, J. C., Knowles, R. ,., Blackburn, T. .. H. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. , 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
