Måling Flusmidler af mineralske Næringsstoffer og giftstoffer i Planter med radioaktive sporstoffer
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
Optagelsen og fordeling af næringsstoffer og giftstoffer kraftig indflydelse plantevækst. Derfor undersøgelse af underliggende transportprocesser udgør en væsentlig forskningsområde i plantebiologi og jordbrugsvidenskab 1,2, især i de kontekster ernæringsmæssige optimering og miljømæssige belastninger (fx salt stress, ammonium toksicitet). Blandt metoderne til måling af flux i planter er brugen af radioisotopiske sporstoffer, som blev udviklet betydeligt i 1950'erne (se f.eks, 3) og fortsætter med at være meget udbredt i dag. Andre metoder, såsom måling af næringsstof udtømning fra roden mediet og / eller akkumulering i væv, anvendelse af ion-selektive vibrerende mikroelektroder såsom MIFE (mikroelektrode ionstrøm estimation) og SIET (scanning ionselektiv elektrode teknik), og anvendelse af ion-selektive fluorescerende farvestoffer er også udbredt, men er begrænsede i deres evne til at detektere netto influenzaxes (dvs. forskellen mellem tilstrømning og udstrømning). Anvendelse af radioisotoper, på den anden side gør det muligt for forskeren enestående evne til at isolere og kvantificere ensrettede strømme, som kan anvendes til at løse kinetiske parametre (fx K M og Vmax), og give indsigt i kapacitet, energetik, mekanismer og regulering, af transportsystemer. Ensrettede flux målinger foretaget med radioaktive sporstoffer er især nyttige under betingelser, hvor fluxen i den modsatte retning er høj, og omsætningen af intracellulære puljer er hurtig 4. Desuden radiotracer metoder tillader målinger skal udføres i henhold til forholdsvis høje substratkoncentrationer, i modsætning til mange andre teknikker (se "Diskussion", nedenfor), fordi den spores isotop observeres på baggrund af en anden isotop af det samme element.
Her giver vi detaljerede trin for radioisotopisk måling af ensrettet og nET flux mineralske næringsstoffer og giftstoffer i intakte planter. Der vil blive foretaget på flux måling af kalium (K +), en plante makronæringsstoffer 5, og ammoniak / ammonium (NH3 / NH4 +), en anden makronæringsstoffer som er imidlertid toksiske, når til stede i høje koncentrationer (f.eks 1- 10 mM) 2. Vi vil anvende radioisotoper 42 K + (t 1/2 = 12,36 timer) og 13 NH 3/13 NH4 + (t 1/2 = 9.98 min), henholdsvis i intakte planter af modelsystemet byg (Hordeum vulgare L .), i beskrivelsen af to centrale protokoller: direkte tilstrømning (DI) og kompartment analyse af sporstof udstrømning (CATE). Vi bør bemærke fra starten, at denne artikel beskriver blot de er nødvendige for at udføre hver protokol. Hvor det er relevant, korte forklaringer af, beregninger og teori forudsat, men detaljerede fremstillinger af hver teknik'S baggrund og teori kan findes i flere vigtige artikler om emnet 4,6-9. Vigtigere er det, disse protokoller er stort set overføres til flux analyse af andre næringsstoffer / giftstoffer (f.eks 24 Na +, 22 Na +, 86 Rb +, 13 NO 3 -) og til andre plantearter, omend med et par protester (se nedenfor) . Vi understreger også betydningen af, at alle forskere, der arbejder med radioaktive materialer skal arbejde under en licens arrangeret gennem deres institutions ioniserende stråling sikkerhed regulator.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som påvist i ovenstående eksempler, radiotraceren metoden er et effektivt middel til at måle ensrettede strømme af næringsstoffer og giftstoffer i planta. Figur 1 viser, at NH3 tilstrømning kan nå over 225 pmol g -1 time -1, som måske er den højeste bona fide transmembranfluxhastigheden nogensinde rapporteret i et plante-system 13, men omfanget af denne flux ville ikke være synlige, hvis der kun netto flusmidler blev målt. Dette er…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
Referências
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G., Lüttge, U., >Pitman, M. .. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. 2 Part A, (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots – A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J., Maathuis, F. .. J. .. M. .. ,. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Volume 953, 161-170 (2013).
- Meeks, J. C., Knowles, R. ,., Blackburn, T. .. H. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. , 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
