Elektronische Zunge generieren Continuous Erkennungsmuster für die Protein-Analyse
Summary
A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.
Abstract
In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.
Introduction
Präzise und schnelle Proteinerkundungsmethoden sind in der medizinischen Diagnostik und der Proteomik sehr wichtig. Klassische Proteindetektions Arrays, wie Biochips, auf der "Schloss-und-Schlüssel" Anerkennung Prinzip und erfordern spezifische Rezeptoren wie Aptamere, Antikörper oder Mimetika.
In den letzten Jahren hat Differenzmess inspiriert durch den menschlichen Geruchssinn und gustation als Alternative 1 entstanden. Diese elektronische Nase / Zunge (DE / ET) Ansatz basiert auf unterschiedlichen Bindung von Analyten auf ein Array von kreuzreaktiven Rezeptoren (CRRs), die nicht brauchen, sehr spezifisch oder selektiv für die Zielmoleküle zu sein auf der Basis ermöglichen so die mühsame zu überwinden Prozess der Entwicklung hochselektiver Rezeptoren. Es ist die kombinierte Antwort aller Rezeptoren, die ein eindeutiges Muster für jede Probe erstellt, wie ein Fingerabdruck, so dass ihre Identifikation.
Die beiden wichtigsten Herausforderungen für die Entwicklung von elektronischen Nase / Lasche wirksame Protein Erfassungs sind die Herstellung von Sensorelementen, die die Fähigkeit zu strukturell ähnlichen Analyten und das entsprechende Übertragungssystem für das Bindungsereignis zu unterscheiden. Bisher wurden Untersuchungen verschiedene Ansätze zur Entwicklung Array 2 angegeben. Beispielsweise in einer Studie einer Array-basierten Identifizierung von Proteinen wurde unter Verwendung von Tetra-CRRs carboxyphenylporphyrin Derivaten hergestellt durch Kopplung der Carboxygruppen an verschiedene Aminosäuren oder Dipeptide Differenz Rezeptoren besitzen einen hydrophoben Kern auf Affinität für Proteine und verschiedene Umfänge berechnet vorsehen entwickelten Vermittlung differentielle Bindung. Mit diesem System wurden verschiedene Proteine und Proteingemische durch Messen der Fluoreszenzlöschung von den Rezeptoren durch die Wechselwirkung mit den Analyten 3,4 identifiziert. In einer anderen Studie wurde eine Bibliothek von 29 CRRs Tripeptid und Boronsäurereste enthalten in einer kombinatorischen Art und Weise synthetisiert auf einem hexasubstituierte Benzolgerüst wurde zur Erfassung Proteine mit einem Indikator-Aufnahme kolorimetrischen Nachweis 5,6 entwickelt. Mit einer solchen Konstruktion, zeigte jeder Rezeptor Differenzbindungskapazität mit Proteinen auf der Basis der Abweichung in den Peptid Arme und der Boronsäuren der Differenzierung von Proteinen aus Glycoproteinen begleitet. In jüngerer Zeit eine Reihe von verschiedenen kationischen funktionalisierten Goldnanopartikel mit einem anionischen fluoreszierenden Polymer Poly (p-phenylenethinylen) (PPE) konjugiert zusammen wurde geschaffen, um zu detektieren und zu identifizieren Proteine 7. Die kompetitive Bindung zwischen Protein Analyten und abgeschreckt PPE / Gold-Nanopartikel-Komplexen regeneriert Fluoreszenz, Herstellung verschiedene Erkennungsmuster für Proteine. In dieser Studie wurden die funktionalisierten Nanopartikel-Protein-Wechselwirkungen durch Variieren physikochemischen Eigenschaften der Nanopartikel-Endgruppen abgestimmt. Weiterhin wurde gezeigt, dass dieser Ansatz wirksam ist für die Proteinanalyse in komplexen und eiweißreichen Medium, wie beispielsals Humanserum bei physiologisch relevanten Konzentrationen, was zeigt, das Potenzial der eT in Profi realen Proben für die Diagnose von Krankheitszuständen 8.
Wenn auch sehr vielversprechend, haben diese Systeme einige inhärente Einschränkungen. Sie erfordern Planung und Synthese von 5-29 CRRs mit recht komplizierten Strukturen. Darüber hinaus, im Gegensatz zu dem olfaktorischen System, der sich mit folgenden jeder Messung Protein Erkundung erfordert Herstellung eines Arrays pro Probe. Schließlich sind die Überwachung in Echtzeit Bindungsereignisse extrem schwierig.
In diesem Zusammenhang wurde ein kombinatorischer Ansatz unter Verwendung einer kleinen Anzahl von einfachen und leicht zugänglichen Molekülen mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften als Bausteine (BBS) 9 vorgeschlagen (hydrophile, hydrophobe und positiv geladene, negativ geladene, neutrale, etc.). Durch Mischen BBs in unterschiedlichen und kontrollierten Anteilen und man die Mischungen zur Selbstorganisation an der Goldoberfläche einerPrisma, ein Array von Flächen mit entsprechenden kombinatorischen Eigenschaften zum Binden von Protein wurde erstellt. Bemerkenswert ist, die selbstorganisierte Monolagen auf diesem System ermöglichen eine einfache Abstimmung der eine Reihe von Oberflächeneigenschaften in einem stark divergent, so dass diverse kombikreuzreaktive Rezeptoren (CoCRRs), um schnell und effizient produziert. Protein Erfassungs wurde unter Verwendung eines optischen Erfassungssystems, Oberflächenplasmonresonanz-Bildgebung (SPRi). Kurz gesagt, beleuchtet ein Breitstrahl monochromatisch polarisierte Licht von einem LED-Array das gesamte CoCRR Bereich auf der Oberfläche des Prismas. Eine hochauflösende CCD-Videokamera bietet Echtzeit-Differenzbilder über alle Orte der CoCRR Array. Es erfasst alle lokalen Änderungen an der Oberfläche des CoCRR Array mit detaillierten Informationen über die Bindungsereignisse und kinetischen Prozessen 10. Dessen mit Hilfe der Bildbearbeitungssoftware SPR entsprechenden Bilder Flecken werden automatisch Variationen der Reflektivität Versu umgewandelts Zeit, Erzeugen einer Reihe von kinetischen Bindungskurven genannte Sensorgrammen. So erlaubt SPRi ein Etikett frei, synchrone, parallele und Echtzeit-Beobachtung von Bindungsereignissen. Zusätzlich wird die erhaltene CoCRR Array regenerierbar und wiederverwendbar für die Proteinanalyse.
Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion des elektronischen Zunge mit nur zwei kleine Moleküle als Bausteine und zeigt seine Anwendung zur Analyse von Proteinen gemeinsam, die auf kontinuierlichen Erkennungsmuster mit SPRi erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte zur Konstruktion dieser eT sind bemüht, eine gute Reproduzierbarkeit des Systems zu gewährleisten. Beispielsweise die Reinigung der Goldoberfläche des Prismas mit einem standardisierten Verfahren vor Verwendung Zugabe von 10% Glycerin in den elf reinen und gemischten Lösungen BB1 und BB2 zur Lösungsmittelverdampfung während BBs selbstorganisierende auf der Goldoberfläche des Prismas zu vermeiden, Abscheiden mehrerer Wiederholungen für jede [BB1] / ([BB1] + [BB2])-Verhältnis, e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Ph.D. grant of LANEF in Grenoble for support of Laurie-Amandine Garçon. This work was financially supported by the French National Research Agency (ANR-grant 06-NANO-045).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25°C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
Referências
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