gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
فتحت الاستخدام الواسع النطاق للجيل القادم تسلسل آفاقا جديدة لأبحاث السرطان والتشخيص. سوف NGS جلب كميات هائلة من بيانات جديدة عن السرطان، وخاصة سرطان علم الوراثة. والمعرفة الحالية والاكتشافات المستقبلية تجعل من الضروري لدراسة عدد كبير من الجينات التي يمكن أن تشارك في الاستعداد الوراثي للسرطان. في هذا الصدد، قمنا بتطوير تصميم Nextera لدراسة الجينات كاملة 11 المشاركة في إصلاح الحمض النووي الضرر. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة الجينات بأمان 11 (ATM، BARD1، BRCA1، BRCA2، BRIP1، CHEK2، PALB2، RAD50، RAD51C، RAD80، وTP53) من المروج ل3'-UTR في 24 مريضا في وقت واحد. هذا البروتوكول، على أساس تكنولوجيا transposase وإثراء gDNA، ويعطي ميزة كبيرة من حيث الوقت لتشخيص بفضل الجيني لعينة المتنوعة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها بأمان مع gDNA الدم.
في عام 2010، ما يقرب من 1.5 مليون شخص (النساء أساسا) تطوير سرطان الثدي في جميع أنحاء العالم. وتشير التقديرات إلى أن 5 إلى 10٪ من هذه الحالات كانت وراثية. قبل 20 عاما تقريبا، تم تحديد BRCA1 و BRCA2 كما تشارك في الثدي وراثي وسرطان المبيض 1. منذ حوالي 15 عاما، تم التسلسل المناطق الترميز BRCA1 و BRCA2 لتحديد استعداد وراثي لسرطان الثدي والمبيض. تم الكشف عن تغييرات في BRCA1 و BRCA2 في 10 إلى 20٪ من الأسر المختارة 2 يشير إلى أن تحليل هذه المناطق ليست كافية لفحص فعالية. مؤخرا، أبرزت تحليل تسلسل غير الترميز (المروج، الإنترونات، 3'UTR) من BRCA1 و BRCA2 أن الطفرات الجديدة / الاختلافات يمكن ربط لخطر الاصابة بسرطان الثدي 3-6.
وتشارك BRCA1 و BRCA2 البروتينات في إصلاح إعادة التركيب مثلي (HHR)، التي أنجزت من قبل العديد من الشركاء 7. في حين التعديلات BRCA1 أو BRCA2 في تحفز عيوب في إصلاح الحمض النووي، والشركاء الآخرين قد يؤثر أيضا من خطر الإصابة بسرطان الثدي. ويبدو أن هذه الفرضية قد تم التحقق من صحة منذ BRIP1 8 و 9 PALB2 يكون لها تأثير مؤكد على سرطان عنق الرحم والثدي، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، الأخريين "مخاطر معتدلة" سرطان الثدي جينات القابلية، أجهزة الصراف الآلي وCHEK2، يمكن أيضا أن تدرس بشكل روتيني 10.
وانطلاقا من هذه الدراسات، قررنا وضع بروتوكول لتحليل جينات 11 (ATM، BARD1، BRCA1، BRCA2، BRIP1، CHEK2، PALB2، RAD50، RAD51C، RAP80، وTP53) في وقت واحد باستخدام 24 مريضا من السهل جدا ونسبيا بروتوكول سريع على أساس تكنولوجيا transposase، مع تخصيب وتسلسل على جهاز الإنتاجية المتوسط. شكرلهذه التقنية، فإننا تسلسل الجينات كاملة من بداية المروج إلى نهاية 3'-UTR، باستثناء RAP80، والتي لم تغطى منطقة intronic من 2،500 سنة مضت (Chr5: 176،381،588-176،390،180). هذا يمثل ما مجموعه حوالي 1000300 BP درس مع 2،734 التحقيقات. عادة، يتم تحليل BRCA1 و BRCA2 تسلسل exonic بواسطة سانجر التسلسل الذي يحتاج 1.5 أشهر لأقل من 20 مريضا. مع هذا البروتوكول (الشكل 1)، في الوقت نفسه، يمكن تحليل الجينات 11 كاملة لأكثر من 75 مريضا.
وقد وفرت انتشار استخدام الأجهزة والتقنيات NGS فرص جديدة في دراسة السرطان والاضطرابات الوراثية. بالإضافة إلى تسلسل الجينوم كله أو RNA تسلسل وتحليل كمية كبيرة من متواليات gDNA مختارة في العديد من المرضى في وقت واحد يوفر فرص كبيرة في التشخيص. هنا، قمنا بتطوير تصميم معين (حسب…
The authors have nothing to disclose.
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |