gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Den utbredte bruken av Next Generation Sequencing har åpnet nye veier for kreftforskning og diagnostikk. NGS vil bringe store mengder nye data om kreft, og spesielt kreft genetikk. Dagens kunnskap og fremtidige funn vil gjøre det nødvendig å studere et stort antall gener som kan være involvert i en genetisk predisposisjon for kreft. I denne forbindelse har vi utviklet en Nextera design for å studere 11 komplette gener involvert i DNA-skade reparasjon. Denne protokollen ble utviklet for å trygt studere 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, og TP53) fra arrangøren til 3'-UTR hos 24 pasienter samtidig. Denne protokollen, basert på transposase teknologi og gDNA berikelse, gir en stor fordel i form av tid for genetisk diagnostikk takket være prøve multipleksing. Denne protokollen kan trygt brukes med blod gDNA.
I 2010, nesten 1,5 millioner mennesker (hovedsakelig kvinner) utviklet brystkreft på verdensbasis. Det er anslått at 5 til 10% av tilfellene var arvelig. Nesten 20 år siden, ble BRCA1 og BRCA2 identifisert som involvert i arvelig bryst-og eggstokkreft en. Siden ca 15 år siden, har BRCA1 og BRCA2 koding regioner blitt sekvensert å bestemme genetisk predisposisjon for bryst og eggstokk kreft. Endringer i BRCA1 og BRCA2 er påvist i 10 til 20% av utvalgte para familier antyder at analysen av disse regionene ikke er tilstrekkelig for effektiv filtrering. Nylig, analyse av ikke-kodende sekvenser (Arrangøren, introner, 3-'UTR) av BRCA1 og BRCA2 fremhevet at nye mutasjoner / varianter kan være knyttet til en høyere risiko for brystkreft 3-6.
BRCA1 og BRCA2 proteiner er involvert i homolog rekombinasjon Repair (HHR), som er utført av mange partnere 7. Mens endringer i BRCA1 eller BRCA2 indusere defekter i DNA-reparasjon, kan de andre partnerne også påvirke risikoen for brystkreft. Denne hypotesen synes å ha blitt validert siden BRIP1 8 og PALB2 9 har en bevist effekt på livmorhals og brystkreft, henholdsvis. I tillegg kan to andre "moderat risiko" brystkreftresistensgener, minibank og CHEK2, også bli undersøkt rutinemessig 10.
Etter på fra disse studiene, har vi besluttet å utvikle en protokoll for å analysere 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, og TP53) i 24 pasienter samtidig ved hjelp av en veldig enkel og relativt fort protokoll basert på transposase-teknologi, med anrikning og sekvensering på et medium gjennomstrømning enhet. Takktil denne teknikk, har vi sekvensert fullstendige gener fra starten av promoteren til enden av 3'-UTR, bortsett RAP80, hvor en intronic regionen i 2500 bp ble ikke dekket (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Dette representerer totalt ca 1.000.300 bp studert med 2734 sonder. Vanligvis er BRCA1 og BRCA2 exonic sekvenser analysert ved Sanger-sekvensering, som trenger 1,5 måneder for mindre enn 20 pasienter. Med den foreliggende protokoll (figur 1), på samme tid, 11 komplette gener for mer enn 75 pasienter kunne bli analysert.
Den utbredte bruken av NGS enheter og teknologier har gitt nye muligheter i studiet av kreft og genetiske lidelser. I tillegg til hele genomet sekvensering eller RNA-sekvensering, gir analysen av en stor mengde av utvalgte gDNA sekvenser i en rekke pasienter som samtidig gode utsikter i diagnose. Her har vi utviklet en bestemt design (tilgjengelig på forespørsel) bruker Nextera teknologi for å studere 11 komplette gener hos 24 pasienter samtidig med et medium throughput sekvense enhet (Table of Materials / utstyr). D…
The authors have nothing to disclose.
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |