gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van<em> BRCA1</em>,<em> BRCA2</em>, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
Het wijdverbreide gebruik van Next Generation Sequencing heeft opengesteld nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar kanker en de diagnose. NGS zal enorme hoeveelheden nieuwe gegevens over kanker, en in het bijzonder de genetica van kanker te brengen. De huidige kennis en toekomstige ontdekkingen maken het noodzakelijk om een groot aantal genen die betrokken kunnen zijn bij een genetische aanleg voor kanker te bestuderen. In dit opzicht hebben we een Nextera ontwerp om 11 volledige genen betrokken bij DNA schade herstel bestuderen. Dit protocol is ontwikkeld om veilig te studeren 11 genen (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 pt TP53) van promotor tot 3'-UTR bij 24 patiënten tegelijk. Dit protocol, gebaseerd op transposasegen technologie en gDNA verrijking, geeft een groot voordeel in termen van tijd voor de genetische diagnose dankzij multiplexing proeven. Dit protocol kan veilig gebruikt worden met bloed gDNA.
Introduction
In 2010, bijna 1,5 miljoen mensen (voornamelijk vrouwen) ontwikkelden borstkanker wereldwijd. Er wordt geschat dat 5 tot 10% van deze gevallen waren erfelijk. Bijna 20 jaar geleden, BRCA1 pt BRCA2 zijn geïdentificeerd als die betrokken zijn bij erfelijke borst-en eierstokkanker 1. Sinds ongeveer 15 jaar geleden, BRCA1 pt BRCA2 coderende gebieden werden gesequenced om de genetische aanleg voor borstkanker en eierstokkanker bepalen. Veranderingen in BRCA1 pt BRCA2 zijn gedetecteerd in 10 tot 20% van de geselecteerde families 2 suggereert dat de analyse van deze gebieden niet voldoende voor doeltreffende screening. Onlangs heeft de analyse van niet-coderende sequenties (promoter, introns, 3-'UTR) van BRCA1 pt BRCA2 benadrukt dat nieuwe mutaties / varianten kunnen worden gekoppeld aan een hoger risico op borstkanker 3-6.
BRCA1 en BRCA2 eiwitten zijn betrokken bij homologe recombinatie Repair (HHR), dat wordt aangevuld met verschillende partners 7. Terwijl veranderingen in BRCA1 of BRCA2 induceren defecten in DNA herstel, kan de andere partners ook invloed op het risico op borstkanker. Deze hypothese lijkt te zijn gevalideerd sinds BRIP1 8 pt 9 PALB2 hebben een bewezen effect op baarmoederhalskanker, borstkanker, respectievelijk. Daarnaast zijn twee andere "matig risico" borstkanker gevoelige genen, ATM pt CHEK2, kan ook worden routinematig 10 bestudeerd.
In het verlengde van deze studies, hebben we besloten om een protocol tot 11 genen (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 pt TP53) bij 24 patiënten te analyseren ontwikkelen tegelijk met behulp van een zeer eenvoudig en relatief snelle protocol gebaseerd op transposasegen technologie, met verrijking en sequencing op een middelgrote doorvoer apparaat. Thanksdeze techniek we de sequentie volledige genen van het begin van de promoter tot eind 3'-UTR, behalve RAP80, waarvoor een intronische gebied van 2500 bp werd niet onder (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Dit komt neer op een totaal van ongeveer 1.000.300 bp studeerde bij 2.734 sondes. Gewoonlijk worden BRCA1 pt BRCA2 exon sequenties geanalyseerd door Sanger sequentiebepaling, die 1,5 maand nodig voor minder dan 20 patiënten. Met de onderhavige protocol (figuur 1), in dezelfde tijd, 11 volledige genen voor meer dan 75 patiënten konden worden geanalyseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het wijdverbreide gebruik van NGS apparaten en technologieën heeft nieuwe mogelijkheden in het onderzoek naar kanker en genetische aandoeningen. Naast whole genome sequencing of RNA sequentie, de analyse van een grote hoeveelheid gDNA geselecteerde sequenties in verschillende patiënten tegelijkertijd biedt grote mogelijkheden in diagnose. Hier ontwikkelden we een specifiek ontwerp (op aanvraag) met Nextera technologie om 11 volledige genen tegelijk bestuderen bij 24 patiënten met een gemiddelde throughput sequencing …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
Referências
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3’UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- . The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).
