के पूरे दृश्य की NGS विश्लेषण के लिए एक Transposase आधारित प्रौद्योगिकी द्वारा gDNA संवर्धन<em> बीआरसीए 1</em>,<em> बीआरसीए 2</emडीएनए क्षति की मरम्मत में शामिल>, और 9 जीन
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के व्यापक उपयोग कैंसर अनुसंधान और निदान के लिए नए रास्ते खोल दिए हैं. NGS विशाल कैंसर पर नया डेटा की मात्रा, और विशेष रूप से कैंसर जेनेटिक्स लाएगा. वर्तमान ज्ञान और भविष्य की खोजों यह आवश्यक कैंसर को एक आनुवंशिक गड़बड़ी में शामिल किया जा सकता है कि जीन की एक बड़ी संख्या का अध्ययन करने के लिए कर देगा. इस संबंध में, हम डीएनए की क्षति की मरम्मत में शामिल 11 पूर्ण जीन अध्ययन करने के लिए एक Nextera डिजाइन विकसित की है. इस प्रोटोकॉल को सुरक्षित रूप से एक साथ 24 रोगियों में 11 जीन (एटीएम, BARD1, बीआरसीए 1, बीआरसीए 2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, और TP53) प्रमोटर से 3'-UTR के लिए अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था. Transposase प्रौद्योगिकी और gDNA संवर्धन पर आधारित यह प्रोटोकॉल, बहुसंकेतन नमूने के लिए आनुवंशिक निदान धन्यवाद के लिए समय के मामले में एक महान लाभ देता है. इस प्रोटोकॉल को सुरक्षित रूप से रक्त gDNA के साथ प्रयोग किया जा सकता है.
Introduction
2010 में, (अनिवार्य रूप से महिलाओं) लगभग 15 लाख लोगों को दुनिया भर में स्तन कैंसर विकसित की है. यह इन मामलों में से 5 से 10% वंशानुगत थे कि अनुमान है. वंशानुगत स्तन और डिम्बग्रंथि के कैंसर 1 में शामिल के रूप में लगभग 20 साल पहले, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 की पहचान की गई. लगभग 15 साल पहले के बाद से, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 कोडिंग क्षेत्रों स्तन और अंडाशय कैंसर को आनुवंशिक गड़बड़ी का निर्धारण करने के लिए अनुक्रम निर्धारण किया गया है. बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 में बदलाव इन क्षेत्रों का विश्लेषण प्रभावी जांच के लिए पर्याप्त नहीं है, सुझाव है कि चयनित परिवारों को 2 से 10 से 20% में पता चला रहे हैं. हाल ही में, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 के गैर कोडन दृश्यों (प्रमोटर, इंट्रोन्स, 3'UTR) के विश्लेषण के नए परिवर्तन / विविधताओं स्तन कैंसर 3-6 के एक उच्च जोखिम से जोड़ा जा सकता है कि प्रकाश डाला.
बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 प्रोटीन (मुताबिक़ पुनर्संयोजन मरम्मत में शामिल रहे हैंकई भागीदारों 7 से पूरा हो गया है, जो HHR),. बीआरसीए 1 या बीआरसीए 2 में परिवर्तन डीएनए की मरम्मत में दोष उत्पन्न करते हैं, अन्य भागीदारों को भी स्तन कैंसर के खतरे को प्रभावित कर सकता है. इस परिकल्पना BRIP1 8 के बाद से मान्य किया गया है प्रकट होता है और PALB2 9 क्रमशः, ग्रीवा और स्तन कैंसर पर एक सिद्ध प्रभाव पड़ता है. इसके अलावा, दो अन्य "मध्यम जोखिम" स्तन कैंसर का खतरा जीन, एटीएम और CHEK2, भी नियमित तौर पर 10 अध्ययन किया जा सकता है.
इन अध्ययनों से पर के बाद, हम एक साथ अपेक्षाकृत एक बहुत आसान और उपयोग कर 24 रोगियों में 11 जीन (एटीएम, BARD1, बीआरसीए 1, बीआरसीए 2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, और TP53) का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने का फैसला एक मध्यम throughput डिवाइस पर संवर्धन और अनुक्रमण साथ Transposase प्रौद्योगिकी पर आधारित तेज प्रोटोकॉल,. धन्यवादइस तकनीक के लिए, हम 2,500 बीपी के एक intronic क्षेत्र में शामिल नहीं किया गया था, जिसके लिए RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 Chr5) के अलावा, 3'-UTR के अंत करने के प्रमोटर के शुरू से ही पूरा जीन अनुक्रम. यह 2734 जांच के साथ अध्ययन के बारे में 1000300 बीपी के कुल का प्रतिनिधित्व करता है. आमतौर पर, बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 exonic दृश्यों कम से कम 20 रोगियों के लिए 1.5 महीने की जरूरत है जो सेंगर अनुक्रमण, से विश्लेषण कर रहे हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल (चित्रा 1) के साथ, एक ही समय में, 75 से अधिक रोगियों के लिए 11 पूर्ण जीन विश्लेषण किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
NGS उपकरणों और प्रौद्योगिकियों के व्यापक उपयोग के कैंसर और आनुवंशिक विकारों के अध्ययन में नए अवसर प्रदान किया है. पूरे जीनोम अनुक्रमण या शाही सेना अनुक्रमण के अलावा, कई रोगियों में चयनित gDNA दृश्यों की एक…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
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