Yayılması<em> Homalodisca coagulata virüs 01</em> Yoluyla<em> Homalodisca vitripennis</em> Hücre Kültürü
Summary
Burada in vitro Homalodisca vitripennis hücreleri ve HoCV-1 yaymak için bir protokol mevcut. Orta HoCV-1 pozitif kültürlerden çıkarıldı ve RNA 168 saat süre ile, her 24 saat ekstre edilmiştir. Hücre yaşayabilirliği tripan mavi ile nicelendirildi. Tüm virüs parçacıkları sonrası enfeksiyon ekstre edildi. Çıkarılan RNA QRT-PCR ile belirlenmiştir.
Abstract
Camsı kanatlı keskin nişancı (Homalodisca vitripennis) güneybatı Amerika Birleşik Devletleri boyunca bulunan bir çok vagile ve polifag böcek türüdür. Bu böcekler Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) baskın vektörleri, asmanın Pierce hastalığı (PH) nedensel ajan bir ksilem sınırlı bakteri vardır. Pierce'ın hastalığı ekonomik zarar olduğunu; Bu şekilde, H vitripennis patojen yönetimi stratejileri için bir hedef haline gelmiştir. Homalodisca coagulata virüs-01 (HoCV-01) olarak tanımlanan bir dicistrovirus H. mortalite artışı ile ilişkili olduğu vitripennis popülasyonları. Bir konakçı hücre HoCV-01 replikasyonu için gerekli olduğundan, hücre kültürü lojistik ve biyolojik böcek öldürücü soyu üretimi için ekonomik açıdan önemli olan çoğaltma hedef için tek tip bir ortam sağlar. Bu çalışmada, H. büyük ölçekli üretimi için bir sistemde Doku kültürü ile vitripennis hücreleri geliştirildi, sViral replikasyon mekanizması roviding. HoCV-01 tüm vücut böceklerden çıkarılabilir ve kültür H'yi inoküle etmek için kullanıldı çeşitli seviyelerde vitripennis hücreleri. Kültür ortamı 168 saat, RNA ekstre edilmiş ve QRT-PCR ile analiz için her 24 saatte uzaklaştırılmıştır. Hücreler, tripan mavisi ile boyandı ve ışık mikroskopisi kullanılarak hücre hayatta kalma ölçmek için sayıldı. Tüm virüs parçacıkların toplam hücre kültürü çöküşü oluşmadan önce olduğu tespit edilen bir zaman noktasında olduğu enfeksiyondan sonra 96 saat, kadar ekstre edilmiştir. Hücreler aynı zamanda floresan boyama tabi ve F-aktin bağlanma ve çekirdekler bütünlüğü viral aktivitesini araştırmak için konfokal mikroskopi kullanılarak incelendi. Bu çalışmanın sonuç olduğunu H. vitripennis hücreleri kültive edilip, bir biyolojik zararlı öldürücünün üretimine olanak sağlamak üzere müsait bir seviyede HoCV-01 kitle üretimi için kullanılan olma yeteneğine sahiptirler.
Introduction
Camsı kanatlı keskin nişancı (Homalodisca vitripennis Germar 1821), Kuzey Amerika'da 1, Xylella fastidiosa (X fastidiosa) baskın bir vektör olarak asma (PD) Pierce hastalığının nedensel ajanı tespit edilmiştir. Böcek nüfus yönetim hızla Kaliforniya ve güney Amerika Birleşik Devletleri genelinde bağcılık sektöründe bu yıkıcı sorunla mücadele için araştırma odağı haline gelmiştir. Familyasına ait olan bir pozitif sens, tek iplikçikli bir RNA virüsü Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virüs 01 (HoCV-01), vahşi H. saptanmıştır vitripennis popülasyonları ve böcek için böceğin direncini düşürürken, bu toplumlarda 2-4 ölümleri arttırdığı gösterilmiştir.
Yöntemlerin geliştirilmesi etkili arka H. enfekte etmek Bir laboratuar ortamında yetişkinliğe vitripennis çünkü zor olmuştur <em> H. vitripennis ana bitkilerin 5-8 çeşitli gerektiren farklı sahne özgü beslenme ihtiyaçları var. Belirli tesisleri arka canlı H. gerekmektedir Amerika Birleşik Devletleri vitripennis; Bu nedenle hücre kültürü daha ekonomik ve etkili bir alternatif, hem de HoCV-01 tespiti ve çoğaltılması 2,9 giderek önem taşımaktadır. H. hücre kültürlerinin kurulması için temel yöntem ise vitripennis, virüsler 2 gibi, bu yöntemler, yine biyolojik kontrol maddelerinin ticari üretimi için normal olarak kullanılmamış olan, tarif edilmektedir.
Aşağıdaki prosedürler genel amacı, biyolojik kontrol maddesi olarak kullanım için müsait HoCV-01 gibi yüksek bir konsantrasyonunun üretmektir. Viral replikasyon neden başarılı H. yetiştirilmesi ve optimize bir canlı hücre gerektirir vitripennis kültürler virüs karlı seviyelerini üretme ilerleme için hayati önem taşımaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Istilacı tarımsal türlerin akını ilişkin artan endişeler gelişmekte olan zararlılara ve patojenlere karşı savunmak için yeni metodolojiler için artan bir talep yol var. Hastalık önleme ve yönetim odağı patojen vektörler yönetimini içerir ve bu çalışmanın birincil hedefi oldu. Ekonomi pratik uygulama büyük alanlar üzerinde ancak düşük bir maliyetle 12 de büyük miktarlarda olması gerekiyor, çünkü tarımda karantinası yönetmek için biyolojik zararlı öldürücünün bu t?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10X) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1X) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1X) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100X) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50X) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ Glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
Referências
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
- Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
- Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
- Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
- Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
- Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. , 9-12 (2009).
- Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
- Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
- Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
- Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
- Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
- Coriell, L. L., Fogh, J. .. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. , 29-49 (1973).
- Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
- Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).
