Summary

Propagazione di<em> Virus-01 Homalodisca coagulata</em> Via<em> Homalodisca vitripennis</em> Cell Culture

Published: September 25, 2014
doi:

Summary

Qui vi presentiamo un protocollo per propagare le cellule Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Media è stato rimosso dalla HoCV-1 colture positive e RNA estratto ogni 24 ore per 168 ore. Sopravvivenza cellulare è stata quantificata trypan colorazione blu. Particelle virali intere sono stati estratti dopo l'infezione. RNA estratto è stato quantificato da qRT-PCR.

Abstract

Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis) è un insetto estremamente polifago vagili e presente in tutto il sud-ovest degli Stati Uniti. Questi insetti sono i vettori predominanti di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), un batterio xilema limitata che è l'agente causale della malattia di Pierce (PD) della vite. Malattia di Pierce è economicamente dannoso; così, H. vitripennis sono diventati un bersaglio per le strategie di gestione del patogeno. Un dicistrovirus identificato come virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) è stata associata a un aumento della mortalità in H. popolazioni vitripennis. Perché una cellula ospite è necessaria per la replica HoCV-01, coltura cellulare fornisce un ambiente uniforme per la replica mirato che è logisticamente ed economicamente importante per la produzione di bio-pesticida. In questo studio, un sistema per la propagazione su larga scala da H. vitripennis cellule tramite coltura tissutale è stato sviluppato, providing un meccanismo di replicazione virale. HoCV-01 è stato estratto da insetti di tutto il corpo e utilizzato per inoculare H. colta vitripennis cellule a diversi livelli. Il terreno di coltura è stato rimosso ogni 24 ore per 168 ore, RNA estratto e analizzato con qRT-PCR. Le cellule sono state colorate con blu trypan e contati per quantificare la capacità di sopravvivenza delle cellule mediante microscopia ottica. Particelle virali intere sono stati estratti fino a 96 ore dopo l'infezione, che è stato il punto di tempo determinato per essere prima totale coltura cellulare crollo si è verificato. Le cellule sono state inoltre sottoposte a colorazione fluorescente e visualizzati mediante microscopia confocale per indagare l'attività virale su attaccamento e nuclei integrità F-actina. La conclusione di questo studio è che H. vitripennis cellule sono in grado di essere colta e utilizzata per la produzione di massa di HoCV-01 a un livello adeguato a consentire la produzione di un biopesticida.

Introduction

Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis Germar 1821) è stata identificata come il vettore predominante di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l'agente causale della malattia di Pierce della vite (PD) in Nord America 1. Insetto gestione della popolazione è rapidamente diventato il centro della ricerca per combattere questo problema devastante per il settore della viticoltura in California e in tutto il sud degli Stati Uniti. Un positivo-senso, virus a RNA a singolo filamento appartenente alla famiglia Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) è stata identificata in H. selvatici popolazioni vitripennis e dimostrato di aumentare la mortalità in quelle popolazioni 2-4, riducendo al contempo la resistenza degli insetti agli insetticidi.

Sviluppo di metodi per efficacemente posteriore infetto H. vitripennis all'età adulta in un ambiente di laboratorio sono stati difficili perché <em> H. vitripennis hanno diverse esigenze nutrizionali specifiche fasi che richiedono una grande varietà di piante ospiti 5-8. Strutture specifiche sono richieste per posteriore H. vivo vitripennis negli Stati Uniti; Pertanto, coltura cellulare è più economico e una possibile alternativa, così come sempre più vitale per HoCV-01 rilevazione e replicazione 2,9. Mentre i metodi di base per stabilire colture cellulari di H. vitripennis sono descritti, questi metodi non sono ancora stati utilizzati per la produzione commerciale di agenti di controllo biologico, come ad esempio i virus 2.

L'obiettivo generale delle seguenti procedure è quello di produrre una elevata concentrazione di HoCV-01 adatto per l'utilizzo come agente di controllo biologico. Replicazione virale richiede una cellula vivente, che è il motivo per cui coltiva con successo e l'ottimizzazione H. vitripennis culture è fondamentale per il progresso di produrre livelli redditizi di virus.

Protocol

Cultura 1. cellulare NOTA: linee cellulari Homalodisca vitripennis stabiliti dal laboratorio Dr. Wayne Hunter presso l'USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) sono stati utilizzati per avviare un magazzino laboratorio composto da fasi cellulari misti inclusi i fibroblasti ei monostrati iniziali. Eseguire le seguenti procedure in un ambiente di laboratorio sterile mantenuta ad una temperatura compresa tra 20-24 ° C con 25 cm 2 fiasche di co…

Representative Results

Attaccamento delle cellule e la crescita è stato visto in 48 ore di passaggio in piccole e grandi fiasche di coltura, da colture primarie e continui passaggi. Crescita dei fibroblasti e sviluppo è stata osservata anche in questo lasso di tempo. Quando fiaschi appena seminati sono stati disturbati prima di 48 ore, c'è stato un calo visibile in adesione cellulare, portando a culture crescita più lenti ea volte senza attaccamento o di crescita a tutti. Le cellule sono state circa il 80% confluenti entro una settima…

Discussion

L'aumento preoccupazioni per quanto riguarda l'afflusso di specie invasive agricole hanno portato ad un aumento della domanda di nuove metodologie per la difesa contro i parassiti e patogeni emergenti. Un focus di prevenzione e gestione della malattia comporta la gestione di vettori patogeni ed era l'obiettivo primario di questo studio. Economia svolgono un ruolo fondamentale nella decisione di produrre questo tipo di biopesticida per gestire vettori di patogeni in agricoltura perché l'applicazione prat…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Corning cell culture flasks Sigma Aldrich CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 Olympus Inverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solution Sigma Aldrich T4049 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Sigma Aldrich M8937 48 wells (TC treated with lid)
DETCA  Sigma Aldrich 228680 Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma Aldrich CLS431206 Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL
Brij 52 Sigma Aldrich 388831 Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution Sigma Aldrich P5244 Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water
TRIzol LS  Life Technologies 10296-028
Agarose Sigma Aldrich A5304 For electrophoresis
Ethidium bromide Sigma Aldrich E7637 BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquick Qiagen 28704
QuantiTect qRT-PCR kit  Qiagen 204243
4% paraformaldehyde  Sigma Aldrich P6148  Reagent grade, crystalline
PBS  Sigma Aldrich P5368 Phosphate buffered saline
Triton X-100  Sigma Aldrich X100
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Rhodamine red-conjugated phalloidin  Life Technologies R415 Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPI  Sigma Aldrich D9542
ProLong Gold Antifade Reagent Life Technologies P36934
LSM510 Meta Confocal System  Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Software Carl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) Sigma Aldrich G8142 H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrate Sigma Aldrich H8125 H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10X) Sigma Aldrich M4530 H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1X) Sigma Aldrich C0422 H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1X) Sigma Aldrich 51322C H2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100X) Sigma Aldrich G3126 H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50X) Sigma Aldrich 56419C H2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solution Sigma Aldrich M8266 H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ Glutamine) Sigma Aldrich G6784 H2G+ leafhopper medium component
Nystatin Sigma Aldrich N6261 H2G+ leafhopper medium component
Gentamycin Sigma Aldrich 46305 H2G+ leafhopper medium component
Dextrose Sigma Aldrich D9434 H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 H2G+ leafhopper medium component

Referências

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Biesbrock, A. M., Powell, C. M., Hunter, W. B., Bextine, B. R. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (91), e51953, doi:10.3791/51953 (2014).

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