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Biology

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

Published: September 23, 2014
doi:
10.3791/52010
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute,Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology,Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine,Hong Kong University, 5Division of Cardiology,Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center,Medical College of Wisconsin

Summary

物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。

Abstract

、損傷した心臓を修復する心臓毒性作用を持っていない新しい治療薬を発見し、かつ正確に心臓病をモデル化するための戦略を改善するためのアプローチを開発する緊急の必要性がある。これらのアプリケーションのための「皿に「心臓の筋肉を生成するために、人間の人工多能性幹細胞（hiPSC）技術を悪用する可能性が高い熱意を生成し続ける。近年、効率的にヒト多能性幹細胞（hPSCs）から心筋細胞を生成する能力が大幅にくれないそうでなければアクセス可能な人間の心臓の開発の非常に初期段階をモデル化するための新たな機会を提供し、改善された。多くの以前の方法とは対照的に、心筋細胞分化プロトコルは、ここに記載した細胞凝集またはアクチビンAまたはBMP4の添加を必要とし、確実に心臓トロポニンIとT（TNNI3、TNNT2）のために非常に陽性である細胞の培養物を生成し、iroquois-ていませんクラスホメオドメインタンパク質IRX-4（IRX4）、ミオシン調節軽鎖2、心室/心筋アイソフォーム（MLC2v）とミオシン調節軽鎖2、すべてのヒト胚性幹細胞（hESCの）とhiPSC系統全体で一日10による心房アイソフォーム（MLC2aは）まで試験日付。細胞は、培養中で90日以上継代し、維持することができる。戦略は、技術的に実施が簡単で費用効果的である。多能性細胞由来の心筋細胞の特徴付けは、多くの場合、mRNAおよびタンパク質レベルの両方で、基準マーカーの分析を含む。タンパク質分析のために、フローサイトメトリー、培養中の細胞の質を評価し、亜集団の均一性を決定するための強力な分析ツールである。しかし、試料調製技術的変化が大幅にフローサイトメトリーデータの品質に影響を与えることができる。このように、染色プロトコルの標準化は、さまざまな差別化戦略間で比較を容易にするはずである。したがって、IRX4、MLC2v、MLC2a、TNNI3、およびTNNの分析のための染色プロトコルを最適化フローサイトメトリーによるT2が記載されている。

Introduction

ヒトES細胞およびhiPSC含むhPSCsから心筋細胞の生成は、機械論的研究のための他の方法でアクセスすることはできませんのステージへの洞察を提供する、非常に初期のヒトの心臓の発生過程のin vitroモデルとして機能することができる。このモデルシステムは、心臓系統のコミットメントと細胞運命の仕様を制御する分子経路を研究するためのユニークな機会を提供しています。近年、効率的hPSCsから心筋細胞を生成する能力が大幅1-15を改善した。しかしながら、プロトコルの中の細胞がチャンバ特異的マーカー（ 例えば 、心室および心房）を発現れる心筋細胞およびタイミングを生成する効率に対する細胞株の変動がある。理想的には、このモデルシステムの将来の応用のために、機能的に定義された細胞のより均一な集団が望まれている。以前の方法とは対照的に、ここで説明する心筋細胞分化プロトコルは、CEのを必要としないロバストLL集約またはアクチビンAまたは骨形成タンパク質4（BMP4）の添加とは、これまでに試験されたすべてのhESCおよびhiPSC行に渡って10日までに細胞TNNI3、TNNT2、IRX4、MLC2v、およびMLC2aための非常に肯定的な文化を生成します。戦略は、特に三次元の文化、大衆文化、または胚様体ベースの戦略4-9と比較して、実装するのは技術的に簡単であり、最近ではhPSCsに対する選択的な毒性を有する小分子（Boheler らを記述する研究で定義した。 ）65。このプロトコルの特徴は、Wntシグナル伝達（同様の、まだ1,2,7,13とは異なる）を調節するために小分子を用いて修飾されたhESCマトリックス（マトリゲル）の単層を用いて単層培養におけるhPSCsの分化、十分に規定された培地を含み、かつ分化効率及びセル識別の評価のための染色方法、最適化フローサイトメトリー。要約すると、これまでの報告に比べて、このプロトコルの利点は、その費用対effectivを含むeness、再現性、ヒトES細胞およびhiPSCラインを含む複数のHPSC線のうち心筋細胞を生成するための高効率。

フローサイトメトリー、培養中の細胞の質を評価し、亜集団の均一性を決定するための強力な分析ツールであり、適切な実験計画で、定量的測定を提供することができる。すべての抗体ベースの戦略と同様に、実験結果の正確な解釈は、準最適条件が著しく抗体の効率に影響を与えるような抗体濃度と固定および透過処理条件（細胞内抗原を標的とする）を含む、アッセイ設計の要素を慎重に各抗体について試験することを必要と、結果の解釈を結合し、したがって。定量が必要な場合、ポリクローナル抗体は、複数のエピトープを認識し、バッチ間の変動を受けやすいことができるように重要なのは、モノクローナル抗体は、不可欠である。現在、抗体の多様性（経口lyclonalおよびモノクローナル）および染色プロトコルが困難プロトコル1,2,9,11間の心筋の効率を比較すること、in vitroでの分化の評価のために記載されている。そのため、モノクローナル抗体は、すべてのフローサイトメトリー分析のために利用可能な場合に使用される。今後は、特に定量に関して、これらの染色プロトコルの標準化が、より良い差別化戦略間で比較を可能にするはずであることが期待される。

in vitroでの心筋の純度を評価するために使用されるマーカーの選択、およびその対応する抗体は、レポート間で変化する。 TNNT2は心筋運命にコミットした細胞の指標とみなされており、日常的に心臓分化プロトコルの効率を評価するために使用される。しかし、TNNT2も早くニワトリおよびラットの開発16,17の間に骨格筋で発現され、それはヒト平滑筋18中に存在する</sup>。このように、TNNT2は必ずしもインビトロでヒト心筋の特異的なマーカーではありません。 MLC2vとMLC2a、日常それぞれ、心室と心房のサブタイプの代理マーカーとして使用されている。しかし、in vitroでの分化との関連で心筋細胞サブタイプを決定するために、MLC2vとMLC2aに頼るとの課題はこれらの遺伝子産物が心臓チューブから成人を通して、心臓の開発を通じて特定の室に限定されないかもしれないという事実から生じる。げっ歯類では心をループし、MLC2a mRNAは、心房/流入路エリアで支配的とMLC2v mRNAは心室/流出路領域において支配的である。ループ状の中心部に位置し、MLC2aとMLC2v mRNAの共発現は、流入管、房室運河、および流出路19,20において観察される。生後3日までに、MLC2v mRNAは、脳室に制限され、生後10日までに、MLC2aは新生児ラット心臓19の心房に制限されています。したがって、解釈心筋効率とサブタイプのアイデンティティに関するデータの参照マーカーレベルの存在と量を考慮しなければならないだけでなく、分析される分化の時点で対応するに発達段階（複数可）を考慮する必要があります。これはhPSCs のin vitro分化によって生成された心筋細胞の成熟段階が最も密接に、胚/胎児発生21〜25のものに類似していることを考えると、特に重要である。このように、出生後の心臓におけるマーカーの空間表現に頼ることは、少なくともいくつかのケースでは、HPSC由来細胞の評価に適しているとは限りません。

それは、ニワトリとゼブラフィッシュ15,20に胚発生を通して心筋に制限されているように、in vitroで心筋細胞のアイデンティティを定義するためのより具体的な基準の開発を促進するための努力では、TNNI3は、インビトロで心筋を評価するための貴重なマーカーであると考えられているそしてヒト胎児骨格筋26には存在しない。 TNNI1が人間の胎児の心臓に存在しているが、TNNI3は正常な成体心臓27,28で唯一TNNIアイソフォームが存在する。心筋細胞サブタイプの同一性に関して、IRX4 29-31は、心室の運命を有する細胞の有益なマーカーである。タンパク質レベルで、IRX4は最近、マウス32における新生児の段階を経て直線状の心臓チューブから心室に限定されることが示されている。従って、フローサイトメトリーによるTNNI3とIRX4の分析のための最適化された染色プロトコルが記載されている。われわれの知る限り、これはフローサイトメトリーによるヒト心筋細胞におけるIRX4レベルの効率的な抗体ベースの染色および分析のための方法の最初の記述である。

Protocol

1。ソリューションとメディアの準備 hESCの適格マトリックスコーティング原液ゆっくりと、4℃で一晩、氷上でのhESC資格のマトリックス（5ml）に解凍。予備冷却し、1.5ミリリットル滅菌マイクロチューブにアリコートを分配し、直ちに-20ºCで保管してください。 注：一定分量の体積を多くに基づいており、一般的に270から350μlの範囲によって異なります。メーカーは、ステ…

Representative Results

0日目に、細胞は、コンパクト形態および最小の細胞破片100％コンフルエントである。 1-2日間で、それは有意な細胞死（40-50％）を観察することが一般的であるが、付着した細胞は、コンパクトな形態（ 図1A）を保持する。この間、培地は、オレンジ、濁っている。ピンク色のメディアは、過剰な細胞死を示し、この場合には、トリパンブルーで確認し、細胞死が70％を超える場?…

Discussion

分化プロトコルの成功に重要分化の開始前に少なくとも5継代のために単一細胞レベルで継代されているhPSCsの高品質な培養物の使用である。それらは細胞系の独立した分化の開始時に、100％コンフルエントである場合にも、同様の分化効率は、日常的に、さまざまなHPSCライン間で観察されている。分化の開始時に、細胞の集密度が≤95％または> 100％である場合、次善の効率が観察される?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、ウィスコンシン医科大学（RLG）はNIH 4R00HL094708-03、MCW研究委員会の新学部賞、カーン財団（スタートアップファンド）によってサポートされていました。香港のテーマに基づく研究スキームT13-706 / 11（KRB）の研究助成評議会; U01 HL099776、CIRM TR3-05556、CIRM DR2A-05394、とAHAは研究者賞（JCW）を設立。 AHAポストドクトラルフェローシップ12POST12050254（PWB）。私たちは、データ収集と原稿を慎重に審査の支援のためのウィスコンシンの血液研究所のフローサイトメトリーのコアでホープキャンベルに感謝します。

Materials

Name of Reagent / Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow cytometry reagents
Phosphate buffered saline (10X) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 for preparation of cells for flow cytometry
5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 for preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6 well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 mL syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding  Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding  Corning 431097 For filter sterilization of bulk media 
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960
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References

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Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).
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