JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Высокая эффективность Дифференциация человека плюрипотентные стволовые клетки, чтобы кардиомиоцитов и характеристика цитометрическим

Published: September 23, 2014
doi:
10.3791/52010
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute,Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology,Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine,Hong Kong University, 5Division of Cardiology,Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center,Medical College of Wisconsin

Summary

В статье описывается подробная методика эффективно дифференцировать человека плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты, выборочно модуляции путь Wnt, а затем с помощью проточной цитометрии анализ опорных маркеров для оценки однородности и идентичности населения.

Abstract

Существует настоятельная необходимость в разработке подходов к ремонту поврежденного сердца, открывая новые терапевтические препараты, которые не имеют токсическое воздействие на сердце, и совершенствования стратегий для точного моделирования болезни сердца. Потенциал использования индуцированного технологию человека плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) для генерации сердечную мышцу "в блюдо" для этих приложений продолжает генерировать высокий энтузиазм. В последние годы, способность эффективно генерировать cardiomyogenic клетки от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) значительно улучшилась, предлагая нам новые возможности для моделирования очень ранние стадии развития сердца человеческого не иначе доступны. В отличие от многих предыдущих методов, протокол дифференциация кардиомиоцитов описано здесь не требует агрегации клеток или добавление активин А или BMP4 и энергично формирует культуру клеток, которые очень положительно для сердечного тропонина I и Т (TNNI3, TNNT2), iroquois- класс гомеодоменовый белокIRX-4 (IRX4), регуляторной легкой цепи миозина 2, желудочка / сердечной мышцы изоформы (MLC2v) и регуляторной легкой цепи миозина 2, мерцательной изоформы (MLC2a) на 10 день по всей человеческой эмбриональной стволовой клетки (чЭСК) и hiPSC линий испытания, чтобы Дата. Клетки могут быть пассировать и выдерживают в течение более чем 90 дней в культуре. Стратегия технически прост в реализации и экономически эффективным. Характеристика кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных клеток часто включает в себя анализ опорных маркеров, как на уровне мРНК и белка. Для анализа белков, проточной цитометрии является мощным аналитическим инструментом для оценки качества клеток в культуре и определения субпопуляционного однородности. Тем не менее, техническая изменение пробоподготовки может значительно повлиять на качество проточной цитометрии данных. Таким образом, стандартизация протоколов окрашивания должны облегчить сравнение между различными стратегиями дифференциации. Соответственно, оптимизированы протоколы окрашивания для анализа IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 и TNNТ2 с помощью проточной цитометрии описаны.

Introduction

Генерирование кардиомиоцитов из hPSCs, в том числе и чЭСК hiPSC, может функционировать в качестве модели в пробирке из самых ранних человеческих сердечных процессы развития, обеспечивая представление этапов не иначе, доступных для механистических исследований. Эта модель системы предоставляет уникальные возможности для изучения молекулярных путей, которые контролируют приверженность сердечной Lineage и клеточных судеб спецификацию. В последние годы, способность эффективно генерировать cardiomyogenic клетки от hPSCs значительно улучшилась 1-15. Тем не менее, среди протоколов есть изменение клеточной линии по отношению к эффективности генерации cardiomyogenic клеток и времени, при котором клетки экспрессируют камеры-специфических маркеров (например, желудочка и предсердий). В идеале, для будущих применений этой модельной системе, более однородные популяции клеток функционально заданных желательны. В отличие от предыдущих способов, протокол дифференциации кардиомиоцитов, описанный здесь, не требует CELL агрегации или добавление активин или костного морфогенетического белка 4 (BMP4) и энергично формирует культуры высоко положительным для TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v и MLC2a днем ​​10 клеток во всех чЭСК и hiPSC линий протестированных на сегодняшний день. Стратегия технически прост в реализации, особенно по сравнению с трехмерных культур, массовой культуры, или эмбриоид тела на основе стратегий 4-9, а в последнее время был определен в исследовании, которое описывает малую молекулу с селективной токсичностью к hPSCs (Boheler соавт. ) 65. Особенности этого протокола включают дифференциацию hPSCs в монослоя культуры с использованием одного слоя из ЭСК квалифицированным матрицы (Matrigel), полностью определенные СМИ, использующие небольшие молекулы для модулирования Wnt сигнализации (похоже, еще отличие от 1,2,7,13), и оптимизирована проточной цитометрии методов окрашивания для оценки эффективности дифференцировки и идентичности клеток. Таким образом, преимущества этого протокола по сравнению с предыдущим отчеты включают его экономическую effectiveness, воспроизводимость и его высокая эффективность генерации кардиомиоцитов между несколькими линиями HPSC, в том числе чЭСК и hiPSC линий.

Проточной цитометрии является мощным аналитическим инструментом для оценки качества клеток в культуре и определения субпопуляционного однородность, и при правильном эксперимента, может обеспечить количественные измерения. Как и во всех стратегий на основе антител, точной интерпретации результатов эксперимента требует, чтобы элементы конструкции анализа концентрации антител в том числе и фиксации и условий проницаемости (при ориентации внутриклеточные антигены) тщательно проверены для каждого антитела, как суб-оптимальных условий существенно повлиять на эффективность антитела связывания, и поэтому, интерпретацию результатов. Важно отметить, что, если требуется количественное, моноклональные антитела имеют важное значение, так как поликлональные антитела могут распознавать множественные эпитопы и склонны к партии к партии вариации. В настоящее время множество антител (POlyclonal и моноклональные) и окрашивания протоколы были описаны для оценки дифференциации в пробирке, что делает его трудно сравнивать эффективность кардиомиогенеза среди протоколов 1,2,9,11. По этой причине, моноклональные антитела, которые используются, когда доступны для всех проточной цитометрии анализа. Забегая вперед, ожидается, что стандартизация этих протоколов окрашивания, особенно в отношении количественного, должны лучше разрешить сравнение между стратегиями дифференциации.

Выбор маркеров, и их соответствующие антитела, используется для оценки чистоты в пробирке кардиомиогенеза варьирует среди отчетов. TNNT2 был считать показателем клеток, совершенных в cardiomyogenic судьбы и обычно используется для оценки эффективности протоколов сердечных дифференцировки. Тем не менее, TNNT2 также экспрессируется в скелетной мышце в начале кур и крыс развития 16,17 и он присутствует в человеческой гладких мышц 18 </sup>. Таким образом, TNNT2 не обязательно является специфическим маркером человеческого кардиомиогенеза в пробирке. MLC2v и MLC2a обычно используются в качестве суррогатных маркеров желудочковых и предсердных подтипов, соответственно. Тем не менее, проблемы с опираясь на MLC2v и MLC2a определить кардиомиоцитов подтип в контексте дифференциации в пробирке связаны с тем, что эти генные продукты не могут быть ограничены на определенный камере на протяжении развития сердца, от сердечной трубки через взрослого. В грызун петлей сердце, MLC2a мРНК является преобладающим в области путей мерцательной / притока и MLC2v мРНК преобладает в регионах желудочка / выносящего тракта. В зацикленной сердце, ко-экспрессия MLC2a и MLC2v мРНК наблюдаются в приток тракта, атриовентрикулярного канала и тракта оттока 19,20. По 3 дней после рождения, MLC2v мРНК ограничивается желудочка и 10 дней после родов, MLC2a ограничивается предсердий в сердца новорожденной крысы 19. Поэтому интерпретацияиз данных о эффективности кардиомиогенеза и подтип идентичность должна учитывать не только наличие и количество уровней опорного маркера, но необходимо учитывать стадию (ы) с развитием в которых временные точки дифференциации, которые анализируются соответствовать. Это особенно важно, учитывая, что стадия созревания cardiomyogenic клеток, полученных путем экстракорпорального дифференциации в части hPSCs больше всего напоминает те из эмбриональной / фетальной развития 21-25. Таким образом, опираясь на пространственной экспрессии маркера в послеродовом сердце может не подходить для оценки HPSC-клеток, полученных, по крайней мере, в некоторых случаях.

В стремлении содействовать развитию более конкретных критериев для определения кардиомиоцитов идентичность в пробирке, TNNI3 считается ценным маркером для оценки кардиомиогенеза в пробирке, как она ограничена сердечной мышцы в течение эмбриогенеза у кур и рыбок данио 15,20и отсутствует в человеческой эмбриональной скелетных мышц 26. В то время как TNNI1 присутствует в сердце плода человека, TNNI3 является единственным TNNI изоформы присутствует в нормальной взрослой сердце 27,28. Что касается кардиомиоцитов подтипа идентичности, IRX4 29-31 является информативным маркером клеток с судьбой желудочка. На белковом уровне, IRX4 недавно было показано, чтобы быть ограничен желудочка с линейной сердечной трубки через неонатальных стадии у мышей 32. Соответственно, оптимизированные протоколы окрашивания для анализа TNNI3 и IRX4 цитометрическим описаны. Насколько нам известно, это первое описание способа для эффективного окрашивания на основе антител и анализа уровней IRX4 в человеческих кардиомиоцитов с помощью проточной цитометрии.

Protocol

1 Решение и СМИ Подготовка чЭСК Квалифицированный Матрица Покрытие со Решение Медленно таять HESC квалифицированную матрицу (5 мл) на льду при 4 ° С в течение ночи. Разлить аликвоты в предварительно охлажденные, 1,5 мл стерильной микропробирок и сразу хранить при температуре -20 ° ?…

Representative Results

В день 0, клетки 100% сливной с компактной морфологии и минимальной клеточного дебриса. В дни 1-2, обычно наблюдать значительное гибель клеток (40-50%), но, прикрепленные клетки сохраняют компактную морфологию (фиг.1А). В течение этого времени, средств массовой информации становится ор…

Discussion

Критическое значение для успеха протокола дифференцировки является использование высококачественных культур hPSCs, которые были пассированных на уровне одной клетки, по крайней мере пять проходов до начала дифференциации. Которые обычно наблюдаются подобные эффективность дифференци…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано NIH 4R00HL094708-03, MCW ГУ МВД Комитет новый факультет премии, и основой Керн (запуска средства) в Медицинском колледже штата Висконсин (RLG); Научно-исследовательский совет по грантам Гонконг Тематический Исследование схемы T13-706 / 11 (КРФ); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, и AHA Основанная Следователь премии (JCW); AHA докторантуру 12POST12050254 (ПРБ). Мы благодарим Надежда Кэмпбелл в проточной цитометрии Ядра Крови исследовательского института Висконсина за помощь в сборе данных и тщательного анализа рукописи.

Materials

Name of Reagent / Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow cytometry reagents
Phosphate buffered saline (10X) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 for preparation of cells for flow cytometry
5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 for preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6 well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 mL syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding  Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding  Corning 431097 For filter sterilization of bulk media 
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk–sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1. HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao, ., Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

Tags

Human Pluripotent Stem CellsCardiomyocyte DifferentiationCardiac DevelopmentCardiac MarkersFlow CytometryIRX4MLC2vMLC2aTNNI3TNNT2
check_url/52010?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image