JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Implantatie van fibrinegel op Muis Lung naar Lung-specifieke angiogenese

Published: December 21, 2014
doi:
10.3791/52012
,
1Vascular Biology Program, Department of Surgery,Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School

Summary

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Abstract

Recente significante vooruitgang in het onderzoek naar stamcellen en bio-ingenieur technieken hebben grote vooruitgang geboekt in het gebruik van biomaterialen om zich te vernieuwen en te herstellen schade in eenvoudige weefsels in de orthopedische en parodontale velden. Pogingen om de structuren en functies van meer complexe driedimensionale (3D) organen zoals de longen regenereren weinig succesvol geweest omdat de biologische processen van orgaanregeneratie zijn niet goed onderzocht. Het wordt steeds duidelijker dat de angiogenese, de vorming van nieuwe bloedvaten, speelt een belangrijke rol bij orgel regeneratie. Nieuw gevormde vasculatures leveren niet alleen zuurstof, nutriënten en verschillende celcomponenten die vereist zijn voor orgaanregeneratie maar ook leerzaam signalen aan de regenererende lokale weefsels. Daarom, om de longen bij een volwassene succes regenereren, moet de long-specifieke micro-omgevingen waarin angiogenese aandrijvingen herstel van lokaal longweefsel recapituleren. Hoewel conventional in vivo angiogenese assays, zoals subcutane implantatie van extracellulaire matrix (ECM) -rijk hydrogels (bijvoorbeeld, fibrine en collageen gels of Matrigel – ECM-eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom cellen), worden op grote schaal gebruikt om het verkennen algemene mechanismen van angiogenese, long-specifieke angiogenese niet goed gekarakteriseerd omdat werkwijzen voor orthotope implantatie van biomaterialen in de longen niet goed vastgesteld. Het doel van dit protocol is om een ​​unieke methode te introduceren in fibrine gel implantaat op de long oppervlak van levende volwassen muis, waardoor de succesvolle recapitulatie van gastheer-long afgeleid angiogenese in de gel. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om de mechanismen die de long-specifieke micro-omgeving controleert angiogenese en alveolaire regeneratie in zowel normale en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Sinds geïmplanteerde biomaterialen vrijkomen en leveren fysieke en chemische signalen naar aangrenzende lung weefsels, kan implantatie van deze biomaterialen op zieke long potentieel normaliseren aangrenzende zieke weefsels, waardoor onderzoekers nieuwe therapeutische benaderingen van verschillende soorten longziekten ontwikkelen.

Introduction

De algemene doelstelling van dit protocol is een methode te introduceren aan fibrine gel implantaat op de long oppervlak van volwassen muizen, die het mogelijk maakt de onderzoekers om de moleculaire mechanismen van long vasculaire en alveolaire ontwikkeling karakteriseren, en om deze kennis benutten om biomimetic materialen die te ontwikkelen van recapituleren fysiologische long vasculaire en alveolaire vorming van diverse longziekten behandelen.

Meer dan 35 miljoen Amerikanen lijden aan chronische longziekten waaronder chronische obstructieve longziekte en pulmonaire fibrose. Deze patiënten hebben een langdurige chronische respiratoire symptomen zoals kortademigheid, pijn op de borst, zeurende hoest, en vermoeidheid, die hun dagelijks leven 1-3 aanzienlijk beperken. Ondanks een grote hoeveelheid inspanning om effectieve therapieën voor deze longziekten te ontwikkelen, momenteel is er geen genezing; Daarom, de kwaliteit van leven voor deze patiënten is slecht en de economische en menselijke kosten zijn high 4-7. Momenteel longtransplantatie is de enige manier om patiënten met eindstadium van chronische longziekten op te slaan. Vanwege het gebrek aan transplantatie donoren, hoge kosten, ernstige complicaties en lage overlevingspercentage 8-11, transplantatie geen optimale benadering. Recente snelle vooruitgang in de tissue engineering technieken heeft onderzoekers nodig om implanteerbare long bio-ingenieur door herbevolken gedecellulariseerde hele long met diverse soorten stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen 12,13. Echter, deze bioengineered longen functioneel in gastheerdieren slechts enkele uren na implantatie 12,14,15. Gebruik makend biomaterialen de complexe structuren en functies van de longen regenereren is ook tamelijk succesvol. Dit kan zijn omdat de belangrijkste biologische processen die volwassen longen regeneratie regeren zijn niet goed onderzocht. In de long, vorming van het vasculaire systeem is een van de vroegste en belangrijkste gebeurtenissen during ontwikkeling en regeneratie 16-21. Nieuw gevormde vasculatures in de long leveren niet alleen zuurstof, voedingsstoffen en diverse mobiele componenten die nodig zijn voor orgel vorming, maar ook leerzaam regulerende signalen naar omliggende cellen 22-25. Zo angiogenese speelt een belangrijke rol in de regeneratieve alveolarization bij volwassen longen 24,26,27. Bovendien gedereguleerde angiogenese bijdraagt ​​aan chronische longziekten zoals chronische obstructieve longziekte (COPD) 28, bronchopulmonaire dysplasie (BPD) 21-23 en longfibrose 29. Dus om efficiënter uit manipuleren longen of behandelen van chronische longziekten ontwikkelen is het noodzakelijk om het werkingsmechanisme van long-specifieke angiogenese begrijpen.

Elk orgaan geeft unieke mechanische en chemische eigenschappen, die kan verschillen tussen fysiologische en pathologische omstandigheden 30-33. Deze orgaanspecifieke microenvironmenten reguleren endotheelcellen gedrag en orkestreren vasculaire netwerkvorming in een orgaan-specifieke manier 24,34-36. Dus om efficiënter uit long regeneratie ontwikkelen, het mechanisme dat long-specifieke angiogenese te worden begrepen. Terwijl conventionele in vivo angiogenese assays zoals subcutane implantatie hydrogel zijn uitgebreid gebruikt voor angiogenese onderzoek 37-39, hebben deze methoden niet herhalen orgaanspecifieke angiogenese. Onlangs is een nieuwe werkwijze te Matrigel implanteren in een elastische schimmel op de muizenlong ontwikkeld en getoond bloedvaten en long epitheelcellen in de gels 22 succesvol werven. Deze unieke benadering kunnen de onderzoekers het mechanisme van long-specifieke angiogenese alsmede interactie tussen bloedvaten en niet-vasculaire longcellen verkennen in fysiologische en pathologische omstandigheden. Sinds 1) Matrigel is niet geschikt voor klinische toepassing; 2) elastic mal gebruikt om de gel kunnen beïnvloeden interacties tussen hydrogels en gastheer longweefsel en 3) de elastische schimmel op de longen veroorzaakt potentieel verminderde longfunctie en pijn tijdens de ademhaling gegoten als een klinisch relevante benadering een 3D fibrine matrix die angiogene factoren (vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) / basische fibroblast groeifactor (bFGF)) is geïmplanteerd op de muizenlong zonder gieten de elastische matrijs, en met succes geïncorporeerd gastheer-long afgeleide angiogenese. Fibrinegel, polymeer fibrillen gegenereerd uit trombinegekliefde fibrinogeen, bekend te vangen diverse angiogene factoren zoals bFGF en VEGF angiogenese versnellen vivo 40,41. Door zijn regeneratieve vermogen en biologisch afbreekbaar 42 wordt fibrine gel veel gebruikt op het gebied van weefselmanipulatie.

Dit artikel introduceert een nieuwe en unieke benadering van fibrine gel implantaat op de long oppervlak van levende adult muis en toont aan dat gastheer-long afgeleide angiogenese wordt geïncorporeerd in de gel in vivo. Deze methode, die onderzoekers in staat stelt long-specifieke angiogenese, zal waarschijnlijk leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen voor verschillende typen longziekten en pogingen tot volwassen long succes regenereren aanzienlijke vooruitgang.

Protocol

NB: De in vivo dierlijke studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het protocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van Boston Children's Hospital (Protocol Nummers: 13-10-2526R, 14-02-2568R) goedgekeurd. Alle geneesmiddelen die gebruikt worden in dit protocol zijn van farmaceutische kwaliteit en deze geneesmiddelen worden bereid onder s…

Representative Results

Om te onderzoeken of gastheer-long afgeleide vasculaire vorming geïncorporeerd in de biomaterialen geïmplanteerd op de longen, fibrine gels aangevuld met belangrijke angiogene factoren VEGF en bFGF (0, 10 en 100 ng / ml elk) werden geïmplanteerd op het oppervlak van levende muis longen gerapporteerd met behulp van Matrigel 22. Fibrinegelen 47 dat deze angiogene groeifactoren bevatten werden vervaardigd zoals getoond in figuur 1a. Na thoracotomie werd een klein gebied van de link…

Discussion

Dit artikel introduceert een nieuwe methode om biomaterialen implanteren op de long oppervlak van levende volwassen muis. Met dit systeem wordt gastheer long-afgeleide angiogenese succesvol geïncorporeerd in het materiaal. Dit systeem stelt onderzoekers overspraak staand tussen endotheelcellen, andere cellen (bijvoorbeeld epitheliale cellen, mesenchymale cellen, immuuncellen) en verschillende ECM componenten die nodig zijn voor lokale angiogenese 50-53 en alveolaire regeneratie 24,54. Hoe…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door fondsen van de American Heart Association (AM), het Amerikaanse ministerie van Defensie (BC074986), en Boston Children's Hospital faculteit Career Development Fellowship (TM, AM). De auteurs danken Amanda Jiang en Elisabeth Jiang voor technische ondersteuning.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Fibrinogen from human placenta Sigma F4883 For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma Sigma T9549 For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164 R&D 493-MV For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF R&D 3139-FB For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific INC RIS 100 For intubation
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-565-35 For intubation
20G Elastic catheter B.Braun 4251652-02 For intubation
MiniVent Ventilator Harvard Apparatus CGS-8009 For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope Fisher Scientific 12-070-515 For surgey
Absobable suture Ethicon PDP304 Surgical suture
Antibody against CD31 BD Biosciences 553370 Immunohistochemistry
Antibody against AQP5 Abcam AB78486 Immunohistochemistry
Antibody against SP-B Millipore AB40876 Immunohistochemistry
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Donaldson, G. C., Seemungal, T. A., Bhowmik, A., Wedzicha, J. A. Relationship between exacerbation frequency and lung function decline in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax. 57, 847-852 (2002).
  2. Lopez-Campos, J. L., Calero, C., Quintana-Gallego, E. Symptom variability in COPD: a narrative review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 8, 231-238 (2013).
  3. Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 183, 431-440 (2011).
  4. Ferrer, M., et al. Chronic obstructive pulmonary disease stage and health-related quality of life. The Quality of Life of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Study Group. Ann Intern Med. 127, 1072-1079 (1997).
  5. Reardon, J. Z., Lareau, S. C., ZuWallack, R. Functional status and quality of life in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Med. 119, 32-37 (2006).
  6. De Vries, J., Kessels, B. L., Drent, M. Quality of life of idiopathic pulmonary fibrosis patients. Eur Respir J. 17, 954-961 (2001).
  7. Sullivan, S. D., Ramsey, S. D., Lee, T. A. The economic burden of COPD. Chest. 117, 5S-9S (2000).
  8. Orens, J. B., Garrity, E. R. General overview of lung transplantation and review of organ allocation. Proc Am Thorac Soc. 6, 13-19 (2009).
  9. Benden, C. Specific aspects of children and adolescents undergoing lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 17, 509-514 (2012).
  10. Lyu, D. M., Zamora, M. R. Medical complications of lung transplantation. Proc Am Thorac Soc. 6, 101-107 (2009).
  11. Trulock, E. P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-fourth official adult lung and heart-lung transplantation report-2007. J Heart Lung Transplant. 26, 782-795 (2007).
  12. Weiss, D. J. Current status of stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Stem Cells. 32, 16-25 (2013).
  13. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123, 4950-4962 (2013).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Tuyl, M., et al. Angiogenic factors stimulate tubular branching morphogenesis of sonic hedgehog-deficient lungs. Dev Biol. 303, 514-526 (2007).
  17. Galambos, C., deMello, D. E. Molecular mechanisms of pulmonary vascular development. Pediatr Dev Pathol. 10, 1-17 (2007).
  18. McGrath-Morrow, S. A., et al. Vascular endothelial growth factor receptor 2 blockade disrupts postnatal lung development. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 420-427 (2005).
  19. White, A. C., Lavine, K. J., Ornitz, D. M. FGF9 and SHH regulate mesenchymal Vegfa expression and development of the pulmonary capillary network. Development. 134, 3743-3752 (2007).
  20. Zhao, L., Wang, K., Ferrara, N., Vu, T. H. Vascular endothelial growth factor co-ordinates proper development of lung epithelium and vasculature. Mech Dev. 122, 877-886 (2005).
  21. Stenmark, K. R., Abman, S. H. Lung vascular development: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Annu Rev Physiol. 67, 623-661 (2005).
  22. Mammoto, T., et al. LRP5 Regulates Development of Lung Microvessels and Alveoli through the Angiopoietin-Tie2 Pathway. . PLoS ONE. 7, e41596 (2012).
  23. Mammoto, T., Jiang, E., Jiang, A., Mammoto, A. ECM structure and tissue stiffness control postnatal lung development through the LRP5-Tie2 signaling system. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 1009-1018 (2013).
  24. Ding, B. S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, 539-553 (2011).
  25. Crivellato, E. The role of angiogenic growth factors in organogenesis. Int J Dev Biol. 55, 365-375 (2011).
  26. Sakurai, M. K., et al. Vascular endothelial growth factor accelerates compensatory lung growth after unilateral pneumonectomy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, 742-747 (2007).
  27. Panigrahy, D., et al. Epoxyeicosanoids promote organ and tissue regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 13528-13533 (2013).
  28. Voelkel, N. F., Douglas, I. S., Nicolls, M. Angiogenesis in chronic lung disease. Chest. 131, 874-879 (2007).
  29. Hanumegowda, C., Farkas, L., Kolb, M. Angiogenesis in pulmonary fibrosis: too much or not enough. Chest. 142, 200-207 (2012).
  30. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  31. Mammoto, A., Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanosensitive mechanisms in transcriptional regulation. J Cell Sci. 125, 3061-3073 (2012).
  32. Westermann, D., et al. Role of left ventricular stiffness in heart failure with normal ejection fraction. Circulation. 117, 2051-2060 (2008).
  33. Merchante, N., et al. Liver stiffness predicts clinical outcome in human immunodeficiency virus/hepatitis C virus-coinfected patients with compensated liver cirrhosis. Hepatology. 56, 228-238 (2012).
  34. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, 310-315 (2010).
  35. Fidler, I. J. Angiogenic heterogeneity: regulation of neoplastic angiogenesis by the organ microenvironment. J Natl Cancer Inst. 93, 1040-1041 (2001).
  36. Folkman, J. How is blood vessel growth regulated in normal and neoplastic tissue? G.H.A. Clowes memorial Award lecture. Cancer Res. 46, 467-473 (1986).
  37. Mammoto, A., et al. A mechanosensitive transcriptional mechanism that controls angiogenesis. Nature. 457, 1103-1108 (2009).
  38. Malinda, K. M. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods Mol Biol. 467, 287-294 (2009).
  39. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
  40. Mammoto, T., Jiang, A., Jiang, E., Mammoto, A. Platelet rich plasma extract promotes angiogenesis through the angiopoietin1-Tie2 pathway. Microvasc Res. 89, 15-24 (2013).
  41. Mosesson, M. W. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost. 3, 1894-1904 (2005).
  42. Bensaid, W., et al. A biodegradable fibrin scaffold for mesenchymal stem cell transplantation. Biomaterials. 24, 2497-2502 (2003).
  43. Teichert-Kuliszewska, K., et al. Biological action of angiopoietin-2 in a fibrin matrix model of angiogenesis is associated with activation of Tie2. Cardiovasc Res. 49, 659-670 (2001).
  44. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). J Cell Sci. 115, 3427-3438 (2002).
  45. Collen, A., et al. Aberrant fibrin formation and cross-linking of fibrinogen Nieuwegein, a variant with a shortened Aalpha-chain, alters endothelial capillary tube formation. Blood. 97, 973-980 (2001).
  46. Mammoto, T., et al. Mechanochemical Control of Mesenchymal Condensation and Embryonic Tooth Organ Formation. Dev Cell. 21, 758-769 (2011).
  47. Murphy, K. C., Leach, J. K. A reproducible, high throughput method for fabricating fibrin gels. BMC Res Notes. 5, 423 (2012).
  48. Matar, A. F., Hill, J. G., Duncan, W., Orfanakis, N., Law, I. Use of biological glue to control pulmonary air leaks. Thorax. 45, 670-674 (1990).
  49. Thetter, O. Fibrin adhesive and its application in thoracic surgery. Thorac Cardiovasc Surg. 29, 290-292 (1981).
  50. Rahbarghazi, R., et al. Juxtacrine and paracrine interactions of rat marrow-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived satellite cells, and neonatal cardiomyocytes with endothelial cells in angiogenesis dynamics. Stem Cells Dev. 22, 855-865 (2013).
  51. Nucera, S., Biziato, D., De Palma, M. The interplay between macrophages and angiogenesis in development, tissue injury and regeneration. Int J Dev Biol. 55, 495-503 (2011).
  52. Joensuu, K., et al. Interaction between marrow-derived human mesenchymal stem cells and peripheral blood mononuclear cells in endothelial cell differentiation. Scand J Surg. 100, 216-222 (2011).
  53. Takakura, N. Role of intimate interactions between endothelial cells and the surrounding accessory cells in the maturation of blood vessels. J Thromb Haemost. 9 Suppl 1, 144-150 (2011).
  54. Plantier, L., Boczkowski, J., Crestani, B. Defect of alveolar regeneration in pulmonary emphysema: role of lung fibroblasts. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2, 463-469 (2007).
  55. Belair, D. G., Murphy, W. L. Specific VEGF sequestering to biomaterials: influence of serum stability. Acta Biomater. 9, 8823-8831 (2013).
  56. Wong, C., Inman, E., Spaethe, R., Helgerson, S. Fibrin-based biomaterials to deliver human growth factors. Thromb Haemost. 89, 573-582 (2003).
  57. Stolzing, A., Colley, H., Scutt, A. Effect of age and diabetes on the response of mesenchymal progenitor cells to fibrin matrices. Int J Biomater. 2011, 378034 (2011).
  58. Vailhe, B., Ronot, X., Tracqui, P., Usson, Y., Tranqui, L. In vitro angiogenesis is modulated by the mechanical properties of fibrin gels and is related to alpha(v)beta3 integrin localization. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 33, 763-773 (1997).
  59. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Eng Part A. 17, 905-914 (2011).
  60. Angio, C. T., Maniscalco, W. M. The role of vascular growth factors in hyperoxia-induced injury to the developing lung. Front Biosci. 7, 1609-1623 (2002).
  61. Kasahara, Y., et al. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema. J Clin Invest. 106, 1311-1319 (2000).
  62. Owen, C. A. Roles for proteinases in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 3, 253-268 (2008).
  63. Demedts, I. K., et al. Elevated MMP-12 protein levels in induced sputum from patients with COPD. Thorax. 61, 196-201 (2006).
  64. Haq, I., et al. Association of MMP-2 polymorphisms with severe and very severe COPD: a case control study of MMPs-1, 9 and 12 in a European population. BMC Med Genet. 11, 7 (2010).
  65. Mercer, P. F., et al. MMP-9, TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patients during exacerbation. Respir Res. 6, 151 (2005).
  66. Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37, 210-221 (2007).
  67. Sivakumar, P., Gupta, S., Sarkar, S., Sen, S. Upregulation of lysyl oxidase and MMPs during cardiac remodeling in human dilated cardiomyopathy. Mol Cell Biochem. 307, 159-167 (2008).
  68. Gomperts, B. N., Strieter, R. M. Stem cells and chronic lung disease. Annu Rev Med. 58, 285-298 (2007).
  69. Lau, A. N., Goodwin, M., Kim, C. F., Weiss, D. J. Stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Mol Ther. 20, 1116-1130 (2012).

Tags

Keywords: AngiogenesisFibrin GelLung RegenerationBiomaterialsImplantationOrthotopicMouse ModelLung-specific MicroenvironmentStem Cell Research
check_url/pt/52012?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012, doi:10.3791/52012 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image