In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
Lesioni a rivestimento endoteliale di un vaso sanguigno viene riparato attraverso la risposta emostatico, o la formazione di un coagulo di sangue. Quando il sangue permea nella matrice extracellulare, fattori tissutali attivano piastrine nel sangue che facilitano l'iniziazione della cascata coagulativa. Il componente chiave meccanica di questo processo di guarigione è la matrice di fibrina, composto da fibre di fibrina che sono altamente elastica, e può sostenere le grandi forze 1-4. Molti ricercatori hanno studiato la struttura di formazione, e la funzione di fibrina ampiamente negli ultimi decenni 5-13.
I pazienti con malattie come il diabete mellito e falciforme hanno un aumentato rischio di sviluppare complicanze trombotiche, come infarto miocardico, cardiopatia ischemica, e colpi 14-19. Oltre 2 milioni di persone sono di nuova diagnosi di diabete mellito ogni anno negli Stati Uniti. Esistono due tipi di diabete: tipo I, dove lacorpo non riesce a produrre quantità sufficienti di insulina, e tipo II, dove il corpo diventa resistente all'insulina. Tra i pazienti diabetici, malattie cardiovascolari (CVD) è la causa per l'80% della morbilità e la mortalità associate con la malattia 20,21.
Anemia falciforme (SCD) è una malattia genetica del sangue che colpisce più di 100.000 persone negli Stati Uniti 22. SCD è una malattia mutazioni puntiformi che induce le cellule rosse del sangue per diventare a forma di mezzaluna, il che rende difficile per le cellule di passare attraverso il sistema vascolare del sangue 23. Entrambi questi stati di malattia aumentano le probabilità di sviluppare condizioni aterotrombotici nel corpo. Uno dei motivi per questo è il risultato di strutture di fibrina alterata e funzione negli stati malati 14,24-26.
In entrambi diabete e anemia falciforme, c'è ipercoagulazione e l'attività hypofibrinolysis che induce aterotrombosi e malattie cardiovascolari (CVD) rispetto ai pazienti sani 17,27,28. E 'noto che hypofibrinolysis promuove la progressione dell'aterosclerosi e genera eventi ischemici ricorrenti per i pazienti con malattia coronarica precoce 29. Nel manoscritto attuale, abbiamo studiato il ruolo di fibrina proprietà fisiche in questo ambiente particolare. Strutture coagulo di fibrina nei pazienti non malati sono composti da fibre sottili, pori più grandi, e in genere meno densa 14,24. La maggiore porosità e coaguli di fibrina meno fitta in pazienti sani sono stati trovati per facilitare fibrinolisi 16. In condizioni hyperthrombotic quali malattia a cellule falciformi diabetica e, vi è un aumento della produzione di fibrinogeno, causando la concentrazione di fibrinogeno aumentare da livelli normali di 2,5 mg / ml in pazienti sani 30-33. Coaguli di fibrina formata in pazienti diabetici sono stati trovati per essere meno porosa, più rigida, avere più punti di ramificazione, e più densa rispetto a sano, non diapazienti Betica 14,24,33-35. La struttura di fibrina alterata è il risultato di meccanismi di glicazione che si verificano nelle proteine coinvolte nella formazione del coagulo. Non enzimatica (irreversibile) glicazione si verifica quando le molecole di glucosio si legano a residui di lisina sulla molecola fibrinogeno, che inibisce il fattore XIIIa umana (FXIIIa) da glutamina e lisina residui opportunamente incrociati collegano 33,36,37.
L'analisi strutturale delle reti di fibrina è stato ampiamente studiato di recente. In particolare, i ricercatori hanno utilizzato la microscopia elettronica e la ricostruzione 3D delle reti di fibrina, 38 indagati come sia intravascolari (endoteliali) cellule e extravascolari (fibroblasti e muscolari lisce) cellule influenzano la struttura di fibrina 39, viscoelastico utilizzati e l'analisi spettrale per analizzare le strutture di fibrina 40, e correlazioni sviluppati tra struttura di fibrina e le proprietà meccaniche utilizzando approcci sperimentali e computazionali 41 </sup>. Il focus di questo studio è stato quello di formulare strutture coagulo in condizioni trombosi cellulare diabetico e falce simulati e di utilizzare la microscopia confocale per l'esame della struttura e funzione dei coaguli in stati malati. Coaguli di fibrina sono formati da fibrinogeno umano, trombina umana, e FXIIIa. I coaguli sono stati lisati con plasmina. Per simulare le condizioni di diabetici, aumento della concentrazione di fibrinogeno è stato incubato in soluzione di glucosio di indurre in vitro fibrinogeno glicazione. Per simulare malattie cella condizioni coagulazione falce, un aumento delle concentrazioni di fibrinogeno sono stati mescolati con ematocrito falciforme raccolti da pazienti, come fatto in precedenza dal nostro gruppo 42. Questi metodi sono stati usati per esaminare la struttura e le funzioni coinvolte nella formazione di coaguli di fibrina fibrinolisi e in condizioni malate, nonché i meccanismi che inducono CVD. Sulla base delle informazioni attuali su queste malattie, le strutture di coagulo di fibrina glicata erano più denso con meno di unnd piccoli pori. I coaguli di fibrina con globuli rossi di pazienti con anemia falciforme (RBC) erano anche più denso e visualizzati aggregazione dei globuli rossi e di cluster di fibrina agglomerati. Questo è un fenomeno ben noto che è stato determinato in precedenza 43. E 'stato anche ipotizzato che il tasso di fibrinolisi sarebbe significativamente più bassa nel coaguli di fibrina glicata con e senza riduzione plasmina rispetto ai sani, di fibrina normale. I risultati hanno mostrato che per coaguli di fibrina glicate, risultati molto diversi tassi lisi stati osservati solo in condizioni di concentrazione di plasmina ridotta. Questa tecnica sperimentale mediante microscopia confocale offre vantaggi significativi rispetto ad altri metodi di imaging perché le cellule e proteine rimangono nel loro stato nativo, che permette la cattura di video in tempo reale dell'attività coagulazione. Questo metodo di coagulazione sinteticamente Induzione è anche più economico e più tempo efficiente di ottenere campioni di pazienti e filtrando individualeproteine ed enzimi. Inoltre, utilizzando proteine ed enzimi separati per sintetizzare coaguli, i coaguli sono stati standardizzati in modo che non ci fosse la variabilità tra i campioni a causa di altre proteine del plasma.
Per ottenere dati significativi sulla struttura dei meccanismi di coagulazione in stati di malattia, è importante isolare i fattori coinvolti nella coagulazione per determinare gli effetti delle proteine e cellule in queste condizioni. Questo protocollo è stato sviluppato per i fini della valutazione della struttura del coagulo di fibrina in stati diabetici e SCD in vitro.
E 'necessario comprendere i meccanismi coinvolti nella formazione di fibrina e fibrinolisi in stati…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
PBS | Life Technologies | 10010031 | |
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |