Dérivation des cellules cardiaques progénitrices de cellules souches embryonnaires

Summary

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Abstract

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

Introduction

La maladie cardiaque demeure la principale cause dans le monde d'aujourd'hui et les taux de mortalité sont restés pratiquement inchangés dans les deux dernières décennies (American Heart Association). Il ya un besoin critique pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir ou inverser insuffisance cardiaque efficace. Une stratégie prometteuse est la thérapie à base de cellules suivant le développement rapide de cellules souches en biologie ^1. À cet égard, les CPC multipotentes peuvent être une excellente source de cellules pour la thérapie en raison de leur capacité à proliférer mais seulement engagé à la différenciation de la lignée cardiaque. Par conséquent, la méthode efficace et robuste pour générer et isoler CPC est d'une grande importance pour les études de thérapie cellulaire cardiaque.

Ce protocole met l'accent sur CPC embryonnaires identifiés lors de l'embryogenèse précoce et comment leur génération à partir de CES. Divers CPC ont été isolés à partir des cœurs embryonnaires et adultes, même à partir de moelle osseuse ^2. Au cours du développement de l'embryon, morphoge osseuseprotéines tromagnétiques (MPG), les membres de type ailes famille du site d'intégration de MMTV (Wnt) et des signaux nodales induisent l'engagement de la Mesp1 ⁺ mésoderme multipotentes ^3. Mesp1 ⁺ cellules se différencient ensuite dans les CPC, ⁴ embryonnaires. Ces CPC sont généralement marquées par HCN4, NK2 homeobox 5 (NKX2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5), et facteur de myocytes activateur 2C (MEF2C), forment champs cardiaques primaires et secondaires, et contribuer à les principales parties du coeur pendant cardiogenèse ^5-10. Les deux NKX2-5 CPC ⁺ et Isl1 ⁺ / ⁺ MEF2C sont capables de se différencier en cardiomyocytes, des cellules musculaires lisses (SMC), et les cellules endotheliales ^8.5. Ainsi ces CPC donnera lieu à vasculaire cardiaque ainsi que les tissus cardiaques et sont une source de cellules idéal pour la thérapie cardiaque à base de cellules. Par conséquent, générer CPC in vitro a été une préoccupation majeure de la recherche dans les études cardiovasculaires. Depuis CES ont une expansion illimitée capacitése représentent les cellules de la MCI au stade de blastocyste, la différenciation des CES dans la suite de la CPC embryonnaires embryogenèse naturel est considéré comme une approche logique et efficace pour obtenir CPC.

Une approche largement appliquée pour obtenir CPC de CES est d'agréger les CES dans EB ^11. Pour améliorer l'efficacité de différenciation, les facteurs chimiques et de croissance définis sur la base de la connaissance du développement cardiaque ont été utilisés ^12-14. Cependant, il n'y a pas de marqueurs CPC définitives, en particulier pas de marqueurs de surface cellulaire, qui sont largement acceptées dans le domaine. Pour résoudre ce problème, les CES sont conçus pour marquer Isl1 ⁺ ou MEF2C CPC ⁺ et leurs dérivés avec les journalistes fluorescents à l'aide système Cre / loxP. La recombinase Cre est frappé dans le cadre du contrôle de Isl1 / MEF2C promoteur / amplificateur. DP modification de la protéine fluorescente ou un gène YFP entraînée par un promoteur constitutif peuvent être activés par excision de l'arrêt de flox codon par la recombinase Cre(ISL1: CRE; pCAG-flox-STOP-flox-GFP ou DP / Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP) ^5,6. Une fois que les CES sont différenciées en seconde CPC sur le terrain de coeur, Isl1 / MEF2C promoteur / amplificateur cre entraîné va activer les journalistes fluorescentes et les CPC peut être enrichi par FACS-purification. En bref, la méthode d'agrégation EB est utilisé pour initier la différenciation ESC. Pour améliorer l'efficacité de différenciation, les cellules différenciées sont traitées avec de l'acide ascorbique (AA) et des facteurs de croissance tels que Bmp4, activine A et le VEGF ^13,15. Ce protocole permet la différenciation PCC robuste et efficace en utilisant la souris et le CES de l'homme.

Protocol

1. Dérivation de souris embryonnaires CPC de Mouse CES Préparer fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) couche nourricière. MEF milieu chaud (10% de FBS dans du DMEM) à 37 ° C. Préparer des plaques revêtues de gélatine. Ajouter 1 ml de 0,1% de gélatine dans de l'eau dans un puits d'une plaque à 6 puits ou 5 ml dans une boîte de 10 cm. Laisser les assiettes ou de plats à 37 ° C ou la température ambiante pendant au moins 30 min. Aspirer la gélatin…

Representative Results

Le protocole montre dérivation de CPC à partir de plusieurs lignées de cellules ES. CES sont agrégées pour former EB à se différencier en CPC. CES sont maintenues en routine sur mangeoires MEF (figure 1A, F) et les mangeoires sont retirés avant la différenciation. Sur agrégation des CES en EB dans un milieu de différenciation (figure 1B, g), le deuxième EB formés sont traités avec Bmp4 activine A et pour améliorer la différenciation du mésoderme dans des lignées cellul…

Discussion

This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability …

Materials

Name	Company	Catalog Number
FBS	Thermo scentific	SH30070.03E
Knockout SR	Life technology	10828028
Knockout DMEM	Life technology	10829018
DMEM	Life technology	11965118
NEAA	Life technology	11140050
GlutaMAX	Life technology	35050061
N2	Life technology	17502048
B27	Life technology	12587010
Ham’s F12	Life technology	11765062
IMDM	Life technology	12440061
Pen/Strep	Life technology	15140122
Pyruvate	Life technology	11360070
Dispase	Life technology	17105041
Stempro-34	Life technology	10639011
DMEM/F12	Life technology	11330032
BSA	Life technology	15260037
Trypsin	Life technology	25200056
Ascobic Acid	Sigma	A5960
1-Thioglycerol	Sigma	M1753
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
VEGF	R&D	293-VE
Bmp4	R&D	314-BP
ActivinA	R&D	338-AC
bFgf	R&D	233-FB
Fgf10	R&D	345-FG
mTeSR	Stemcell technologies	5850
Matrigel	BD Biosciences	354277